Использование псевдовирусных векторов для поиска и изучения эффективных антиретровирусных препаратов

• Автор: Григорьев, Илья Владимирович
• Шифр специальности: 03.01.04, 03.01.03
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2013
• Место защиты: Новосибирск
• Количество страниц: 122 с. : ил.

Оглавление
1 Список сокращений
2 Введение
3 Обзор литературы
3.1 Способы трансфекции ДНК
3.1.1 Доставка ДНК в клетки при помощи ПАВ
3.2 Рекомбинантные системы на основе ретровирусов
3.2.1 Жизненный цикл ВИЧ
3.2.2 Взаимодействие с рецепторами и проникновение в клетку
3.2.3 Репликация и транскрипция ВИЧ
3.2.4 Сборка и выход новых вирусных частиц
3.2.5 Лентивирусные векторы для доставки ДНК в клетки
3.2.6 Конструкция биобезопасных и высокоэффективных векторов на основе ВИЧ-1.
3.2.7 Получение репликационно-дефектных лентивирусных препаратов
3.2.8 Преобразование вируса в вектор
3.2.9 Эволюция дизайна векторов
3.2.10 Структура используемой трехплазмидной лентивекторной системы
3.2.11 Упаковочная кассета экспрессии (Вспомогательная / хелперная плазмида)
3.2.12 Векторные кассеты (Трансферный вектор)
3.2.13 Вектор экспрессии вирусной оболочки
3.2.14 Псевдотипирование лентивирусных векторов
3.2.15 Структура используемой в исследовании трехплазмидной псевдолентивирусной системы и функции различных компонентов вектора
3.3 Ингибиторы ВИЧ
3.4 Ингибиторы ВИЧ на основе интерферирующих РНК
3.4.1 Расщепление дцРНК
3.4.2 Регулирование транскрипции
3.5 Заключение обзора литературы
4 Материалы и методы
4.1 Реактивы, используемые в работе
4.1.1 Приготовление электрокомпетентных клеток культуры JM
4.1.2 Электропорация бактериальных клеток с использованием ячеек Bio-Rad
4.1.3 Электропорация клеток линии МТ-4 с использованием ячеек Bio-Rad
4.1.4 Протокол выделения плазмид из бактериальной культуры с помощью набора PureYield Plasmid Maxiprep system
4.2 Получение псевдотипированных лентивирусных препаратов и исследование их свойств
4.2.1 Исследуемые соединения для трансфекции
4.2.2 Трансфекция ДНК с помощью новых соединений
4.2.3 Определение цитотоксичности соединений к клеткам линии НЕК293Т
4.2.4 Определение эффективности формирования комплексов катионный трансфектант - ДНК
4.2.5 Анализ трансфекции клеток методом проточной цитометрии
5 Результаты и обсуждение
5.1.1 Стабильность выделенных очищенных лентивекторов
5.1.2 Инфекционность для разных культур клеток. Исследование стабильности
получаемых препаратов, определение оптимального метода проведения инфицирования

5.1.3 Ингибирование псевдолентивирусной инфекции в лимфоидных клетках линии МТ-4 и моноцитах линии
5.2 Новые катионные липидные трансфектанты как средства доставки плазмидной ДНК в клетки
5.2.1 Формирование комплексов исследуемых соединений с ДНК
5.2.2 Определение цитотоксичности соединений на клетках линииНЕК293Т
5.2.3 Определение эффективности трансфекции клеток НЕК293Т
5.3 Оценка эффективности антиретровирусных препаратов на основе интерферирующих РНК с применением псевдолентивирусной системы в клетках
5.3.1 Выбор мишеней для РНК-интерференции
5.3.2 Получение рекомбинантных псевдолентивирусов и подавление их продукции интерферирующими РНК
5.3.3 Определение вирусного титра и эффективности ингибирования продукции лентивирусов с помощью анти-ВИЧ вйШЧА
6 Заключение
7 Выводы
8 От автора
9 Список литературы

1 Список сокращений
ATP - аденозин-5'-трифосфат
att Attachment sites сайты связывания интегразы
B-CLL В-cell chronic lymphocytic leukemia Хронический лимфоцитарный лейкоз
bGHpA bovine growth hormone polyadenylation последовательность полиаденилирования гормона роста коров BMI1 В lymphoma Mo- MJ1V insertion region 1 homolog ген, кодирующий
репрессорный белок, влияющий на регуляцию белков р16 и р19, являющихся ингибиторами клеточного цикла CD46 рецептор системы комплемента
CD50 Концентрация, при которой 50% популяции клеток погибают
СНМР Комитет по производству лекарственных препаратов для человека
cHS4 последовательность сайта гиперчувствительности
CMV Цитомегаловирус
CMVie ранний протеин, экспрессирующийся в зараженных цитомегаловирусом
CRM1 Главный кариоферин, экспортин, отвечающий за экспорт белков из
ядра.
СТЕ Конститутивный транспортный элемент
CTS Central Termination Sequence центральная терминирующая последовательность DC-SIGN Dendritic Cell-Specific Intercellular adhesion molecule-3-grabbing Non-integrin Рецептор пектинов С-типа, представленный как в дендритных клетках, так и макрофагах
dGTP - дезозксирибогуанозин-5'-трифосфат
DMSO - диметилсульфоксид
dNTP - дезоксирибонуклеозид-5'-трифосфат
dTTP - дезоксириботимидин-5'-трифосфат
EGF Epidermal growth factor Эпидермальный фактор роста
Env ген поверхностного вирусного белка
FACS Fluorescence-activated cell sorting Проточная цитометрия
флуоресцентно активированных клеток FIV Вирус иммунодефицита кошек
Flp От “flip" рекомбиназа дрожжей, используемая в сайт-направленной
рекомбинации FM fusion molecule молекула для слияния
FSC Forward Scattering прямое светорассеяние
дад Один из трех главных генов ВИЧ. Кодирует 4 структурных белка,
формирующих вирусный капсид GFP Green fluorescent protein Зеленый флуоресцентный белок
др120 Поверхностный гликопротеин ВИЧ
gpt ген гуанинфосфорибозилтрансферазы
Hepes - [1-(2-гидроксиэтил)пиперазин-М’-2-этансульфоновая кислота
hSCF фактор стволовых клеток человека
HSPCs hematopoietic stem progenitor cells гематопоэтические стволовые/
прогениторные клетки HTLV Human T-lymphotropic virus Т-лимфотропный вирус человека
НХВ2 Молекулярный клон ВИЧ
l-Scel site-specific homing enzyme Нуклеаза рестрикции, расщепляющая

К trans - детерминантам относятся вирусные белки, формирующие структуру вирусного капсида, поверхностный белок, определяющий специфичность заражения клеток, ферменты цикла вирусной репликации, регуляторные белки (Rev и Tat) и вспомогательные белки (Vpr, Vif, Vpu и Nef) (Таблица 1). Упаковочная/хелперная плазмида psPAX2 кодирует основные структурные белки и ферменты лентивирусной частицы в нескольких рамках считывания - Gag, Pro и Pol, и некоторые из регуляторных и вспомогательных вирусных белков.
3.2.12 Векторные кассеты (Трансферный вектор)
Трансферная плазмида экспрессирует полноразмерную геномную РНК вектора, которая содержит все цис-действующие элементы, необходимые для эффективной упаковки, обратной транскрипции, ядерного импорта и интеграции в геномную ДНК инфицируемых клеток. Как правило, плазмида вектора содержит трансгенную экспрессионную кассету с целевым геном, управляемым внутренним промотором, обычно расположенным между 3'Tat/Rev SA сайта и 3'LTR. Конструкция кассеты вектора развивались параллельно с развитием упаковочных кассет. Ранние конструкции содержали интактные 5' и 3' LTR, и, таким образом, транскрипция была Tat - зависимой. В полученный полноразмерный транскрипт вошли последовательности TAR, PBS, SD и psi, присутствующие в 5'-UTR, последовательности в 300-400 п.н., полученной из гена gag, RRE
последовательности акцепторного сайта сплайсинга (SA), а также последовательности РРТ и полиА в 3 'LTR. Трансген со своим промотором был помещен между этими последовательностями [89, 92] [103].
Ранее было показано, что гетерологичные энхансеры/промоторы NFAT, NF-кВ и сайты связывания транскрипционных факторов Sp1 в районе U3, включенные в LTR ВИЧ-1 взамен Т-клеточно-специфичного фактора транскрипции (LEF-1/TCF-1а), побуждают транскрипцию из химерных LTR в отсутствии Tat, и такие модифицированные вирусы являются репликационно-компетентными [138]. Основываясь на этих ранних исследованиях, Тат-независимая транскрипция векторной кассеты была выполнена заменой энхансер/промоторной последовательности в районе U3 5'LTR сильным гетерологичным промотором, полученным от цитомегаловируса [138], как это было сделано ранее для МЯВ [139]. Такие трансферные векторы в настоящее время являются неотъемлемой