Образование 8-оксогуанина в ДНК и активных форм кислорода в растворах под действием тепла и методы их определения

• Автор: Масалимов, Жаксылык Каирбекович
• Шифр специальности: 03.00.04
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2003
• Место защиты: Пущино
• Количество страниц: 122 с. : ил

ОГЛАВЛЕНИЕ
ВВЕДЕНИЕ
ЧАСТЬ I. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ
Глава 1. Активные формы кислорода
1.1. Синглетный кислород
1.2. Супероксид - анион радикал
1.3. Перекись водорода
1.4. Гидроксильный радикал
1.5. Биологическая роль АФК
Г лава 2. Антиоксидантная защита клетки
Глава 3. 8-оксогуанин - биомаркер окислительного повреждения
ДНК активными формами кислорода
3.1. Методы определения 8-оксогуанина
3.2. Репарация 8-оксогуанина в ДНК
3.3. 8-оксогуанин в процессах старения, мутагенеза и канцерогенеза
3.4. Окислительные повреждения ДНК гипертермофильных микроорганизмов
ЧАСТЬ II. ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНОЕ ИССЛЕДОВАНИЕ
Глава 4. Материалы и методы исследования
4.1. Материалы
4.2. Выделение ДНК
4.3. Определение 8-ОГ в ДНК
4.4. Иммобилизация ДНК на нитроцеллюлозных фильтрах
4.5. Фотоокисление ДНК под действием видимого света в присутствии метиленового голубого
4.6. Характеристики основных растворов
4.7. Определение перекиси водорода в растворах
4.8. Очистка люминола
ЧАСТЬ III. РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ
Глава 5. Иммуноферментные методы определения 8-ОГ в ДНК

5.1. Первоначальный вариант ХИФА
5.1.1. Приготовление образцов
5.1.2. Измерение хемилюминесценции
5.1.3. Определение чувствительности метода
5.2. Усовершенствованный вариант ХИФА
5.2.1. Приготовление образцов
5.2.2. Измерение хемилюминесценции
5.3. Неконкурентный ИФА
Глава 6. Образование 8-оксогуанина в ДНК под действием тепла
Глава 7. Образование Н202 под действием тепла
7.1. Образование Н202 в ФБ под действием тепла
7.2. Образование Н2О2 в бидистиллированной воде
под действием тепла
7.3. Образование Н2О2 в морской воде под действием тепла
Глава 8. Образование 8-ОГ в ДНК под действием тепла обусловленных 75 генерацией АФК
Глава 9. Образование и репарация 8-ОГ в ДНК печени и мозга мышей
после действия у -излучения
ЗАКЛЮЧЕНИЕ
ВЫВОДЫ
СПИСОК ОСНОВНЫХ СОКРАЩЕНИЙ И ОБОЗНАЧЕНИЙ
СПИСОК ЦИТИРУЕМОЙ ЛИТЕРАТУРЫ

ВВЕДЕНИЕ
Одним из наиболее значимых повреждающих факторов окружающей среды, действующих на биологические молекулы, являются активные формы кислорода (АФК). Активные формы кислорода (перекись водорода, синглетный кислород, супероксид анион радикал, гидроксильный радикал и др.) возникают при воздействиях ионизирующей радиации, под действием множества различных химических мутагенов и канцерогенов (ксенобиотики, токсины, красители, лекарственные препараты и др.), а также в результате естественного (многочисленные ферментативные реакции, дыхательная цепь митохондрий, аутоокисление внутриклеточных метаболитов и др.) и, в особенности, нарушенного аэробного клеточного метаболизма.
Повреждающее действие АФК наблюдается при их высоких концентрациях. Показано участие АФК в патогенезе свыше 100 заболеваний и патологических состояний [Коркина и др., 1998; Владимиров и др., 1991; Castellani et. al., 1995; De Sole et. al., 1989; Halliwell and Grootveld, 1987; Kehrer and Smith, 1994]: болезни сердечно-сосудистой системы, бронхо-легочные заболевания, заболевания нервной системы и др.
Повышенная генерация АФК приводит к окислительным повреждениям белков, липидов, нуклеиновых кислот и других биологических молекул. Одной из наиболее чувствительных и биологически важных мишеней при повреждении ДНК активными формами кислорода является гуанин, а продуктом повреждения 8-ОГ [Kasai et.al., 1984]. 8-ОГ в настоящее время считается одним из основных биомаркеров окислительного повреждения ДНК [Griffiths et al., 2002]. Доказана связь между образованием 8-ОГ и такими процессами как мутагенез [Брусков и др., 1992; Moria and Grollman, 1993], канцерогенез [Olinski et al., 2002], старение [Beckman and Ames, 1998ab] и патогенез болезней пожилого возраста [Зенков и др., 2001]. Известно, что 8-оксогуанин обладает способностью образовывать ошибочные пары (miscoding) как с цитозином (как немодифицированный гуанин) так и с аденином. Что в свою очередь ведет к мутационным трансверсиям типа Г:Ц -» А:Т.
Повышенное содержание 8-оксогуанина в ДНК или биологических жидкостях, таких как сыворотка крови и моча, является биологическим маркером физиологического неблагополучия организма. Поэтому исследование механизмов образования 8-ОГ в ДНК при различных воздействиях необходимо для более глубокого понимания процессов мутагенеза, канцерогенеза, старения и ряда

очень трудно подобрать определение в биологических терминах. В настоящее время существует довольно большое количество теории старения (Зотин и Зотина, 1993). Однако наиболее обоснованной является свободнорадикальная теория старения предложенная Харманом [Harman, 1968; Harman, 1956; Harman and Piette, 1966; Harman, 1978]. В этой теории предполагается, что процессы старения обусловлены разрушительным действием (на молекулярном уровне) свободных радикалов, образующихся при перекисном окислении органических молекул. Имеется много фактов свидетельствующих о том, что с возрастом повышается содержание в тканях человека и животных продуктов окислительного повреждения макромолекул, в том числе ДНК [Гродзинский и др.,1987; Фролькис и Мурадян, 1988; Ozawa, 1997]. Окислению ДНК активными формами кислорода отводится ведущая роль в процессах старения [Halliwell and Aruoma, 1991]. В настоящее время в ряде работ показано, что происходит увеличение содержания 8-оксогуанина при старении организма [Fraga et al., 1990; Mecocci et al., 1993; Hayakawa et al, 1991; Hayakawa et al, 1992; Hirano et al., 1995; Kaneko et al., 1996]. Например, в опытах на крысах-самцах (Fischer 344 от 6 до 30 месяцев) показано увеличение содержания 8-ОГ в ДНК клеток кожи с возрастом [Tahara et al., 2001]. Обнаружено, что в ДНК лейкоцитов в крови человека со временем идет накопление 8-ОГ [Lodovici et al., 2000; Bogdanov et al., 2000 ].
Причем, это накопление носит нелинейный характер, ярко выраженный в пожилом возрасте [Hayakawa et al, 1991; Hayakawa et al, 1992; Kaneko et al., 1996]. Этот процесс особенно характерен для митохондриальной ДНК, поскольку окислительное повреждение митохондриальной ДНК более чем на порядок величины превышает повреждение ядерной ДНК [Droge, 2001]. Накопление окислительных и других повреждении в ядерной и митохондриальной ДНК при старении и их роль в этом процессе рассмотрены в ряде обзоров [Perez-Campo et al., 1998; Holmes et al., 1992; Droge, 2001]. Одним из наиболее существенных “проявлений” при старении является значительное увеличение образования перекиси водорода в митохондриях и клетках стареющих тканей [Souza-Pinto et al., 1999; Sohal., 1993]. Показано зависимое от возраста накопление окислительных повреждений в ДНК мышечных тканей и мутационных делеции митохондриальной ДНК обезьян и крыс [Zainal et al., 2000; Wanagat et al., 2001]. Связь старения с образованием 8-ОГ подтверждают также данные, полученные при изучении ряда болезней сопровождающих старение, таких как атеросклероз (обнаружение 8-ОГ в атеросклеротических бляшках сосудов у крыс), болезнь Паркинсона, болезнь Альцгеймера [De la Monte et al, 2000; Marinet et