Выделение и физико-химические свойства протеолитических ферментов желудочно-кишечного тракта сома европейского Silurus glanis L.

• Автор: Улитина, Нина Николаевна
• Шифр специальности: 03.00.04
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2005
• Место защиты: Краснодар
• Количество страниц: 171 с. : ил.

1. АНАЛИТИЧЕСКИЙ ОБЗОР
1Л. Характеристика исследуемых ферментов рыб и других
позвоночных животных
1Л Л. Пепсины
1Л.2. Трипсины
1Л.З. Химотрипсины
1 Л.4. Эластазы
1Л.5. Аминопептидазы
2. МАТЕРИАЛ И МЕТОДЫ
2Л. Материал и реактивы
2.2. Очистка ферментов
2.2.1. Приготовление водных экстрактов, определение инактивации исследуемого материала при обработке ацетоном
2.2.2. Осаждение белков сульфатом аммония, диализ, концентрирование растворов
2.2.3. Гель-хроматография, обессоливание препаратов
2.2.4. Ионообменная хроматография
2.2.5. Изоэлектрофокусирование, определение изоэлектрических точек ферментов
2.3. Определение активности ферментов
2.3.1. Определение активности протеиназ по природным
субстратам
2.3.2. Определение активности протеиназ по синтетическим субстратам
2.4. Определение количества белка

2.5. Изучение физико-химических свойств ферментов
2.5.1. Определение диапазонов pH стабильности и активности
2.5.2. Определение температурного оптимума действия
2.5.3. Определение влияния ионов металлов и ингибиторов
2.5.4. Определение молекулярных масс
2.6. Статистическая обработка результатов
3. РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ
3.1 Анатомо-гистологические особенности пищеварительного
тракта сома
3.2. Выделение и очистка протеолитических ферментов сома
европейского
3.2.1. Определение содержания протеиназ в желудочно-кишечном тракте и влияние обработки ацетоном на их активность
3.2.2. Осаждение исследуемых ферментов сульфатом аммония
3.2.3. Разделение и обессоливание водорастворимых белков слизистой оболочки желудка гель-хроматографией
3.2.4. Определение изоэлектрических точек протеиназ слизистой оболочки желудка
3.2.5. Разделение ферментов слизистой оболочки желудка ионообменной хроматографией
3.2.6. Разделение и обессоливание водорастворимых белков поджелудочной железы гель-хроматографией
3.2.7. Определение изоэлектрических точек протеиназ поджелудочной железы
3.2.8. Разделение ферментов поджелудочной железы ионообменной хроматографией
3.3. Свойства протеолитических ферментов сома европейского
3.3.1. Пепсины
3.3.2. Трипсины
3.3.3. Химотрипсины
3.3.4. Эластазы
3.3.5. Аминопептидазы
ЗАКЛЮЧЕНИЕ
ВЫВОДЫ
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

Эластаза, выделенная и частично очищенная из пилорических придатков полосатого тунца Euthynnus pelamis, имела молекулярную массу 24 ООО Да. Максимальной амидазной активностью эта эластаза обладала при pH 8,5 (субстрат - СТАПНА). Температурный оптимум действия этого фермента был определен при 50°С. Ингибиторы сериновых протеиназ угнетали активность этого фермента [Joakimsson К., Nagayama F., 1990].
Из поджелудочной железы тропического тунца Thynnus albacoza была выделена эластаза с молекулярной массой 27 ООО Да. При pH 8,0 эта протеиназа обладала наибольшей амидазной и протеолитической активностью. Активность эластазы тунца угнеталась ингибиторами сериновых протеиназ [Smine A. et al.,
1992].
Эластазы, выделенные из поджелудочных желез куньей акулы Mustelus manazo, ската Dasyatic akajej, радужной форели Salmo gairdneri, угря Anguilla japonica, морского окуня Lateolabrax japonicus и морского черта Lophiomus setigerus имели одинаковые молекулярные массы 26 ООО Да и обладали максимальной амидазной активностью при pH 7,5-7,9 (субстрат - СТАПНА) [Yoshinaka R. et al., 1985].
Cohen T. et al. (1981) в гепатопанкреасе карпа Cyprinus carpio обнаружил две эластазы имеющие одинаковые молекулярные массы 25 ООО Да, определенные электрофорезом в SDS-полиакриламидном геле. Одна из этих эластаз была очищена ионообменной хроматографией на ДЭАЭ-целлюлозе при pH 8,0 и аффинной хроматографией на Д-аргинин-сефарозе. При анализе структуры молекулы этой эластазы карпа, состоящей из 238 аминокислотных остатков, было обнаружено значительное сходство с панкреатической эластазой I свиньи. Значение молекулярной массы этого фермента, рассчитанное по аминокислотному составу, было равно 25 680 Да. Максимальную амидазную активность эта эластаза проявляла в области pH от 6,8 до 9,7, с оптимумом при pH 8,5. В диапазоне pH от 5,0 до 9,0 в присутствии 0,1 М СаСЬ и температуре 4°С фермент был стабилен в течение одной недели. Активность эластазы карпа угнеталась ово-мукоидами кур и индеек, куриным овоингибитором. Ингибитор Кунитца из сои