Новый механизм Ca2+-зависимой регуляции родопсинкиназы

• Автор: Григорьев, Илья Игоревич
• Шифр специальности: 02.00.10
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2012
• Место защиты: Москва
• Количество страниц: 136 с. : ил.

Оглавление
Список сокращений
Введение
1. Обзор литературы: «Родопсинкиназа как представитель семейства протеинкиназ рецепторов, сопряжённых с О-белками»
1.1. Рецепторы, сопряжённые с О-белками, и их протеинкиназы
1.1.1. Рецепторы, сопряжённые с О-белками
1.1.2. Десенситизация рецепторов, сопряжённых с О-белками
1.1.3. Семейство протеинкиназ рецепторов, сопряжённых с О-белками
1.2. Экспрессия ОЮС в различных клетках и тканях
1.3. Структурная организация протеинкиназ рецепторов, сопряжённых с О-белками
1.4. Устройство генов, кодирующих протеинкиназы в-белок-сопряжённых рецепторов
1.5. Внутриклеточная локализация протеинкиназ О-белок-сопряжённых рецепторов
1.6. Механизм активации протеинкиназ рецепторов, сопряжённых с О-белками, активированными рецепторами
1.7. Регуляция активности протеинкиназ рецепторов, сопряжённых с О-белками
1.7.1. Аутофосфорилирование и фосфорилирование под действием других протеинкиназ
1.7.2. Са2+-зависимая регуляция
1.7.3. Другие механизмы регуляции активности ОИК
1.8. Родопсинкиназа и фосфорилирование родопсина

1.8.1. Общая схема фототрансдукции
1.8.2. Взаимодействие родопсинкиназы с родопсином и его фосфорилирование
1.8.3. Участки фосфорилирования родопсина родопсинкиназой
1.8.4. Рековерин как Са2+-сенсор родопсинкиназы
2. Материалы и методы
2.1. Использованные материалы и бактериальные штаммы
2.2. Приготовление Са2+-буферных растворов
2.3. Выделение наружных сегментов палочек сетчатки
2.4. Получение фоторецепторных мембран, отмытых мочевиной или гипотоническим буфером
2.5. Очистка родопсинкиназы из наружных сегментов палочек
2.6. Очистка кальмодулина из мозга быка
2.7. Приготовление химически компетентных бактериальных клеток
2.8. Трансформация бактериальных клеток плазмидной ДНК
2.9. Выделение плазмидной ДНК
2.10. Экспрессия в бактериальных клетках и очистка рекомбинантного рековерина
2.11. Определение активности родопсинкиназы
2.12. Получение рекомбинатных фрагментов родопсинкиназы
2.12.1. Конструирование генов, кодирующих фрагменты родопсинкиназы в виде химерных белков с глутатион 8-трансферазой
2.12.2. Отбор клонов
2.12.3. Экспрессия в бактериальных клетках и очистка химерных белков 08Т-ЮС
2.13. Спектроскопия поверхностного плазмонного резонанса
2.13.1. Иммобилизация рекомбинантных фрагментов родопсинкиназы на поверхности сенсорного чипа
2.13.2. Изучение взаимодействия фрагметов родопсинкиназы с кальмодулином и родопсином
2.13.3. Определение констант диссоциации комплексов кальмодулина с фрагментами родопсинкиназы
2.14. Метод аффинного соосаждения
2.15. Аналитические процедуры
2.15.1. Электрофорез ДНК в агарозном геле
2.15.2. Электрофорез белков в полиакриламидном геле в присутствии додецилсульфата натрия
2.15.3. Иммуноблоттинг
2.15.4. Измерение концентрации белков
3. Результаты и обсуждение
3.1. Са2+-зависимая регуляция родопсинкиназы кальмодулином
3.1.1. Изучение влияния кальмодулина на фосфорилирование родопсина
3.1.2. Выявление участков связывания кальмодулина в молекуле родопсинкиназы
3.1.2.1. Изучение взаимодействия 19- и С-концевого регуляторных доменов родопсинкиназы с кальмодулином
3.1.2.2. Изучение взаимодействия фрагментов N-концевого домена родопсинкиназы с кальмодулином
3.1.2.3. Изучение взаимодействия кальмодулина с рековерин-связывающим участком родопсинкиназы

Таблица 1. Белки, регулирующие активность протеинкиназ семейства 01К [61].
„ Регулируе- Ткань/ , „
Белок ' Функция Ссылки
мая ОКК клетки
Посредством фосфорилирования
Протеинкиназа А
Протеинкиназа С
ERK1/2
Рецептор фактора роста тромбоцитов Р (PDGFRP)
c-Src
GRK2
GRK1,
GRK7
GRK1,
GRK7
GRK5
GRK2
GRK2
GRK2
GRK2
GRK2
НЕК293 Фосфорилирование по остатку Ser685 [123]
улучшает связывание GRK2 с Gpy, транслокацию GRK2 к мембране и фосфорилирование рецепторов.
НЕК293, от Фосфорилирование GRK1 и 7 протеин- [114]
vitro киназой А снижает их способность фос-
форилировать родопсин от vitro
Палочки Фосфорилирование GRK1 и 7 протеин- [115]
мышей, киназой А значительно усиливается при [116]
колбочки темновой адаптации сетчатки и резко
Xenopus снижается при освещении
COS-1 Фосфорилирование GRK5 протеинкина- [120]
зой С по С-концу снижает её каталитическую активность как по отношению рецепторам, так и к нерецепторным субстратам
СНО, Фосфорилирование GRK2 протеинкина- [122]
НЕК293 зой С по С-концу повышает её каталити-
ческую активность по отношению к мембранным рецепторам, но не к растворимым субстратам
НЕК293 Фосфорилирование GRK2 под действием [127]
ERK1/2 по Ser670 снижает связывание G|3y и киназную активность
НЕК293 PDGFRp фосфорилирует GRK2, что при- [131]
водит к активации GRK2 и фосфорилиро-ванию самого рецептора
Клетки Агонист-зависимое фосфорилирование [124]
COS-1,ot остатков ТугІЗ, 86, 92 GRK2 под дейст-
vitro вием c-Src усиливает активность GRK2
Клетки Фосфорилирование GRK2 под действием [125]
НЕК293 c-Src усиливает связывание Gaq с GRK2
Посредством белок-белковых взаимодействий
Кальмодулин
Рековерин
Синтаза оксида азота;
S-нитрозотиолы
GRK5>
GRK6»
GRK2
GRK1
GRK2
Клетки
COS-1,
in vitro
In vitro
Клетки HEK293, клетки остеосаркомы U2, in vivo
Взаимодействие ОІЖ е кальмодулином ингибирует их активность посредством снижения способности протеинкиназ связывать рецепоры и липиды; кальмодулин активирует аутофосфорилирование
011X5, которое ингибирует связывание С11К5 с рецепторами
Связывание рековерина ингибирует активность СЫС1
8-нитрозилирование ОЛК2 синтазой оксида азота или Э-нитрозотиолами ингибирует её киназную активнось
[172]
[147]
[136]
[137]
[149]