Изучение структурно-функциональной организации ДНК-зависимой РНК-полимеразы E. coli методами аффинной модификации и направленного Fe2+-зависимого расщепления

• Автор: Козлов, Максим Викторович
• Шифр специальности: 02.00.10
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 1999
• Место защиты: Москва
• Количество страниц: 114 с. : ил.

ОГЛАВЛЕНИЕ
ВВЕДЕНИЕ
ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ
1.1. ДНК-полимераза I E
1. 1. 1. Кристаллическая структура фрагмента Клёнова
1. 1.2. Мутационно-генетические исследования
полимеразного домена ДНК-полимеразы I E
1. 1.3. Аффинная модификация ДНК-полимеразы I E
1. 2. Обратная транскриптаза HIV
1.2. 1. Кристаллическая структура обратной транскриптазы HIV
1. 2. 2. Мутационно-генетические исследования
полимеразного домена обратной транскриптазы HIV
1. 2. 3. Аффинная модификация обратной транскриптазы HIV
1.3. РНК-полимераза бактериофага Т7
1.3. 1. Кристаллическая структура РНК-полимеразы
бактериофага
1.3.2. Мутационно-генетические исследования РНК-полимеразы
бактериофага
1.3.3. Аффинная модификация РНК-полимеразы
бактериофага
1. 4. РНК-полимераза E
1. 4. 1. Кристаллическая структура РНК-полимеразы E
1. 4. 2. Мутационно-генетические исследования
РНК-полимеразы E
1. 4. 3. Аффинная модификация РНК-полимеразы E
Заключение
ГЛАВА 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
2. Т. Бактериальные штаммы
2. 2. Плазмиды и олигонуклеотиды
2.3. Питательные среды
2. 4. Компетентные клетки и трансформация бактерий
2. 5. Модифицирующие реагенты
2. 6. Выделение плазмидной ДНК
2. 7. Неденатурирующий электрофорез ДНК
и выделение ДНК из гелей
2. 8. Денатурирующий электрофорез РНК и ДНК
2. 9. Денатурирующий электрофорез белков
2. 10. Полимеразная цепная реакция (ПЦР)
2. 11. Выделение РНК-полимеразы
2. 12. Определение активности РНК-полимеразы
2. 13. Модификация РНК-полимеразы в инициационных комплексах
рифамицин-связанными нуклеотидами
2. 14. ЯЕЕ-индуцированное расщепление промоторной ДНК
в составе открытого комплекса
2. 15. ЯЕГ-индуцированное расщепление РНК-полимеразы
в составе инициационного комплекса
2. 16. Модификация РНК-полимеразы в инициационных комплексах
5’-(А/-метилимидазол)-нуклеотидами
2. 17. Модификация РНК-полимеразы в инициационных комплексах
5’-фотоактивными нуклеотидами
2. 18. Модификация РНК-полимеразы в ранних элонгационных
комплексах 5’-фотоактивной РНК
2. 19. Модификация РНК-полимеразы в элонгационных
комплексах 5’-фотоактивной РНК
2. 20. Модификация РНК-полимеразы в элонгационных
комплексах фотоактивными транскриптами
2. 21. Модификация РНК-полимеразы в элонгационных
комплексах фотоактивной ДНК
2. 22. Химические способы расщепления
субъединиц РНК-полимеразы
2. 22. 1. Частичное расщепление по остаткам метионина
2. 22. 2. Частичное расщепление по остаткам цистеина
2. 22. 3. Частичное расщепление по связи N-G
ГЛАВА 3. РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ
3. 1. Структура активного центра РНК-полимеразы E
в инициационном комплексе
3.1.1. Схема модификации РНК-полимеразы
3. 1. 2. Локализация районов модификации
3. 1.3. Структура активного центра
3. 2. Изучение центра связывания РНК-полимеразы E.coli
с рифамицином В
3.2. 1. Синтез коньюгата рифамицин-ЕДТА(Ге2+)
3. 2. 2. Расщепление промоторной ДНК в открытом комплексе
3. 2. 3. Расщепление РНК-полимеразы в инициационном комплексе
3. 3. Изучение “коридора выхода ” 5’-конца РНК-продукта
в инициационных и ранних элонгационных комплексах
3.3. 1. Модификация РНК-полимеразы на стадии инициации
3.3.2. Модификация РНК-полимеразы на стадии элонгации
3. 4. Пространственная организация тройного
элонгационного комплекса
В результате место сшивки было идентифицировано как остаток Lys631 (инв. АК мотива В). С помощью направленного мутагенеза для РПТ7 были получены АК замены Lys631 на Gly, Leu и Arg, которые значительно изменяли полимеразную активность мутантных ферментов (Maksimova et а!., 1991).
Для картирования центра связывания мономер-субстрата в РПТ7 в отсутствии ДНК был использован фотоактивный аналог АТР, 8-азидо-АГР. Концентрационная зависимость фотоприсоединения аналога к ферменту имела вид кривой с насыщением. В присутствии АТР модификация могла быть полностью подавлена. Исчерпывающее расщепление меченного белка бромцианом, хроматографическое разделение полученных фрагментов и последующее их сиквенирование позволило идентифицировать три района модификации: Р314-М362 (I), L550-M666 (II) и F751-M861 (III). Пептиды (II) и (III) включают мотивы В и С, соответственно, что подтвердило представления об общем устройстве активного центра ДНК-зависимых полимераз (Knoll et al., 1992).
Взаимодействие РПТ7 с неспецифической одноцепочечной ДНК было изучено с помощью фотомодификации фермента олигонуклеотидами длиной от 8 до 50 оснований. В центральную часть каждого из олигонуклеотидов был введён фотоактивный остаток трёхкольцевого гетероцикла, псоралена. Рассчитанное на основании эффективности фотосшивки РПТ7 с 24-мерным производным значение /<с/=3,74х10-7 М
было сравнимо по величине с для некоторых промоторных
последовательностей фага 77. Картирование контактов было выполнено путём исчерпывающего трипсинолиза модифицированного белка, выделения меченных пептидов ионообменной хроматографией,