Выделение и структурная характеристика белково-пептидных антибиотиков растительного происхождения

• Автор: Финкина, Екатерина Ивановна
• Шифр специальности: 02.00.10
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2011
• Место защиты: Москва
• Количество страниц: 170 с. : ил.

Оглавление
1. Введение
2. Белково-пептидные антибиотики как компоненты врожденного иммунитета растений (обзор литературы)
2.1. Механизмы распознавания фитопатогена
2.1.1. РАМР-активируемый иммунитет растений
2.1.2. Активируемый эффекторами иммунитет растений
2.1.3 Передача сигнала
2.2. Основные защитные стратегии растений
2.3. Белково-пептидные антибиотики растений
2.3.1. Общая характеристика
2.3.2. Возможные механизмы антимикробного действия
2.3.3. Растительные PRP
2.3.4. Другие антимикробные белки
2.3.5. Растительные АМП
2.4. Стратегии возможного применения растительных белково-пептидных антибиотиков
3. Материалы и методы
3.1. Оборудование
3.2. Реактивы и расходные материалы
3.3. Методы
3.3.1. Выделение PRP из семян чечевицы
3.3.2. SDS-электрофорез
3.3.3. Электроблоттинг
3.3.4. Масс-спектрометрический анализ
3.3.5. Определение N-концевой аминокислотной последовательности
3.3.6. Определение С-концевых аминокислотных остатков
3.3.7. Восстановление и алкилирование
3.3.8. Триптический гидролиз
3.3.9. Выделение суммарной РНК
3.3.10. Обратная транскрипция и амплификация концов кДНК (RACE)
3.3.11. Клонирование и секвенирование продуктов ПЦР
3.3.12. Определение антимикробной активности
3.3.13. Исследование влияния выделенных белков на активность протеолитических ферментов
3.3.14. Исследование взаимодействия LTP чечевицы с IgE
4. Результаты и обсуждение
4.1. Получение и фракционирование исходного препарата из проращенных семян чечевицы обыкновенной Lens culinaris
4.2. Выделение и структурно-функциональная характеристика нового дефенсина Lc-def
4.3. Выделение и структурно-функциональная характеристика ингибиторов протеаз
4.4. Выделение и структурно-функциональная характеристика новых липид-транспортирующих белков Lc-LTP
5. Выводы
6. Благодарности
7. Библиографический список
8. Список сокращений

1. Введение
Повсеместное присутствие патогенных микроорганизмов является одним из основных неблагоприятных факторов окружающей среды, и способность противостоять их воздействию является ключевым моментом в жизни биологического вида. В ходе эволюции растения и животные выработали ряд эффективных защитных механизмов. Важнейшим компонентом защитной системы высших животных является адаптивный иммунный ответ, который характеризуется специфическим распознаванием микроорганизма и наличием иммунной памяти. Для растений описаны такие характерные только для них защитные стратегии как гиперчувствительный ответ, утолщение клеточной стенки, повышение концентрации фитогормонов, обеспечение локальной и системной резистентности, в том числе путем синтеза белков, связанных с патогенезом (Pathogenesis-Related Proteins или PRP), и вторичных метаболитов, обладающих антимикробным действием.
Среди всех имеющихся в арсенале растений защитных механизмов особый интерес у исследователей вызывает синтез PRP. В настоящее время выделены и охарактеризованы PRP представителей различных ботанических семейств. Эти стресс-индуцируемые белки растений подразделяются на 17 классов и синтезируются только в ответ на воздействие неблагоприятных факторов, таких как присутствие фитопатогенов, дефицит влаги, механическое повреждение, изменение температуры или обработка химическими агентами. Общим для PRP является относительно низкая молекулярная масса, устойчивость к воздействию протеаз и сред с низкими значениями pH, наличие сигнальной последовательности в структуре предшественника, преимущественно
внеклеточная локализация и антимикробная активность. На сегодняшний день выделено и охарактеризовано большое число PRP из различных растений. Однако механизмы антимикробного действия большинства растительных антибиотиков до конца не исследованы и находятся в стадии изучения.

контролем. В случае животных, нарушение защиты от собственных токсичных веществ приводит к серьезным повреждениям и развитию аутоиммунных заболеваний. Растительные антимикробные белки и пептиды не оказывают токсического действия на собственные клетки и ткани.
К растительным антибиотикам, мишенью антимикробного действия которых является клеточная стенка микроорганизмов, являются обладающие гидролитической активностью глюканазы и хитиназы. Специфичность антимикробного действия и отсутствие токсического влияния на растительные клетки у данных белков связаны с особенностями строения клеточной стенки бактерий, грибов и растений. Клеточная стенка расположена снаружи цитоплазматической мембраны и выполняет структурную, защитную и транспортную функции. У бактерий она состоит из пептидогликана (муреина) и пронизывающих его тейхоевых и липотейхоевых кислот (в случае грамположительных бактерий). Основными у большинства грибов компонентами клеточной стенки являются полисахариды - азотсодержащий хитин, построенный из остатков N-ацетилглюкозамина, и состоящий из мономеров D-глюкозы глюкан. Хорошо изученной является клеточная стенка дрожжей Saccharomyces cerevisiae: на внутренней стороне ее находится хитин; средняя часть представляет собой трехмерную сетку, образованную молекулами [3-1,3-глкжана, стабилизированными водородными связями; на внешней стороне находятся молекулы р-1,6-глюкана и гликозилированные белки [293]. Клеточные стенки высших растений, как было упомянуто выше, построены в основном из целлюлозы, гемицеллюлозы и пектина. На примере хитиназы риса было показано, что различная чувствительность фитопагенных грибов к действию данного PRP коррелирует с количеством экспонированных на поверхности клеточной стенки хитиновых волокон [364].
Многие выделенные из млекопитающих, амфибий, насекомых, растений и бактерий АМП являются мембранотропными и оказывают свое действие на уровне цитоплазматической мембраны микроорганизма. Общими свойствами