Изучение ингибирования тромбина аптамерными олигонуклеотидами

• Автор: Завьялова, Елена Геннадиевна
• Шифр специальности: 02.00.10
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2013
• Место защиты: Москва
• Количество страниц: 195 с. : ил.

СОДЕРЖАНИЕ
Список сокращений
Введение
Глава I. Обзор литературы
§ 1.1 Образование и функции тромбина в крови
Каскад свертывания крови
Методы изучения каскада свертывания крови in vitro
Коагуляция
Тест генерации тромбина
§ 1.2 Ферментативная активность тромбина
Структура сгтромбина
Низкомолекулярные субстраты тромбина
Гидролиз фибриногена тромбином
§ 1.3 Ингибиторы ферментативной активности тромбина
Классификация ингибиторов
Ингибиторыпептидомиметики
Белковые ингибиторы тромбина
Антитромбин III
Кофактор IIгепарина
Тромбомодулин
Гирудины
Ботроярацин
Гемадин
Пептидные ингибиторы тромбина
Гиругены
EGF-пептид
Бивалентные пептидные ингибиторы тромбина
Гирулоги
Модификация гирулогов
Гирунормы

Другие ингибиторы активного сайта, соединенные с
гиругеном
Вариегин
Ингибиторы по экзосайту II тромбина
Гепарин
у’-пептид
Синтетический ингибитор к экзосайту II
§ 1.4 Аптамерные олигонуклеотиды - новая парадигма
ингибиторов тромбина
15'ТВА - минимальный Б-квадруплекс-фармакофор
Дуплексные элементы структуры в комбинации с
Б-квадруплексным фармакофором
Соединение нескольких С-квадруплексных фармакофоров
Б-квадруплекс содержащий ДНК-аптамер к экзосайту II
тромбина
Бифункциональные ДНК-аптамеры к тромбину
РНК-аптамеры к тромбину
Глава II. Экспериментальная часть
§ 2.1 Материалы
§ 2.2 Методы исследования
Разделение фибринопептидов
Идентификация фибринопептидов
Получение и очистка Е-домена фибриногена
Поверхностный плазмонный резонанс^ связывание тромбина
и Е-домена фибриногена
Определение радиусов гирации фибриногена и
асеоциатов фибрина
АСМ асеоциатов фибрина
ПЭМ асеоциатов фибрина
Определение мутности раствора турбидиметрическим методом
Изучение ингибиторов тромбина турбидиметрическим методом

Преформирование аптамеров
Проведение экспериментов с конкурирующими лигандами
Изучение ингибирования аптамерами тромбинов животных
Изучение влияния гиругена и аптамеров на гидролиз
низкомолекулярного субстрата разными формами тромбина
Получение плазмы крови животных
Проведение коагуляционных тестов
Нормирование результатов коагуляционных тестов
для разных препаратов тромбинов
Эксперименты in vivo
Построение и моделирование кривых
Глава III. Результаты и их обсуждение
§ 3.1 Теоретическое моделирование гидролиза фибриногена
тромбином
Схема реакции
Выбор приближения для описания кинетики
гидролиза фибриногена
Описание кинетики гидролиза фибриногена в
квазиравновесном приближении
Моделирование образования протофибрилл и
последующего отщепления фибринопептида В
§ 3.2 Описание экспериментальных данных разработанной моделью...75 Определение констант ассоциации и диссоциации
комплекса тромбин-фибриноген
Моделирование отщепления фибринопептидов и
образования промежуточных форм фибрина
Определение степени ассоциации фибрина по
динамическому светорассеянию
§ 3.3 Моделирование турбидиметрической кривой
Светорассеяние
Геометрия фибрина и его асеоциатов

гирудином. Среди них были и фрагменты разной длины, и модифицированные пептиды: N-ацетилированные, сульфатированные по 63 остатку тирозина и с заменами аминокислот (118, 151-156). Наименьшим фрагментом, сохраняющим высокую активность, оказался сульфатированный по 63 остатку тирозина (Tys) фрагмент 54-65 гирудина (152-156): Gly Asp Phe Glu Glu Ile Pro Glu Glu Tys Leu Gin (гируген).
Показано, что к потере ингибирующей активности приводит как замена гидрофобных аминокислотных остатков, так и замены отрицательно заряженных остатков (152, 153). Заряженные аминокислотные остатки ориентируют пептид на экзосайте I тромбина, а гидрофобные остатки непосредственно взаимодействуют с поверхностью тромбина (157).
Для гиругенов получено множество рентгеновских структур бинарных комплексов с тромбином, а также тройных комплексов с тромбином и ингибитором активного сайта фермента. Лишь часть из полученных структур перечислена в табл. 5. Независимо от длины пептида, кристаллизуется минимальный фрагмент 54-65, либо еще более короткий фрагмент 55_64.
Кинетических данных получено немного, и те разнородны (табл. 5). Такое положение вещей связано с тем, что в отличие от ингибиторов, непосредственно блокирующих активный сайт тромбина, гиругены действуют на активный сайт аллостерически. Поэтому в зависимости от используемого низкомолекулярного субстрата они могут приводить к увеличению или уменьшению скорости гидролиза (25, 156, 158-160). Ингибирующее действие гиругенов правильнее изучать в реакции гидролиза фибриногена. Измерение времени образования фибринового сгустка показало, что сульфогируген имеет ICso на порядок меньше, чем несульфатированный гируген (152, 153). Эти данные подтверждены и в ингибировании гидролиза кофактора II гепарина. Однако, кажущиеся константы ингибирования, определенные по отщеплению фибринопептидов очень близки: 0,76 мкМ для несульфатированного