Механизмы поддержания трехмерной организации генома

• Автор: Гущанская, Екатерина Сергеевна
• Шифр специальности: 03.01.03
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2013
• Место защиты: Москва
• Количество страниц: 135 с. : ил.

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ
ВВЕДЕНИЕ
I. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ
1.1. МЕХАНИЗМ РАБОТЫ ЭНХАНСЕРОВ
1.1.1. КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ МОДЕЛЕЙ РАБОТЫ ЭНХАНСЕРОВ
1.1.2. МОДЕЛЬ АКТИВАТОРНОГО ХРОМАТИНОВОГО БЛОКА КАК РАЗВИТИЕ ПЕТЛЕВОЙ МОДЕЛИ ДЛЯ СЛУЧАЯ С НЕСКОЛЬКИМИ ПРОМОТОРАМИ/ЭНХАНСЕРАМИ
1.2. ПРОСТРАНСТВЕННАЯ ОРГАНИЗАЦИЯ ТРАНСКРИПЦИИ В КОНТЕКСТЕ КОМПАРТМЕНТАЛИЗАЦИИ КЛЕТОЧНОГО ЯДРА
1.2.1. ПОНЯТИЕ О ТРАНСКРИПЦИОННЫХ ФАБРИКАХ
1.2.2. СООТНОШЕНИЕ ПОНЯТИЙ «ТРАНСКРИПЦИОННАЯ ФАБРИКА» И «АКТИВАТОРНЫЙ ХРОМАТИНОВЫЙ БЛОК»
1.2.3. ТРАНСКРИПЦИОННЫЕ ФАБРИКИ КАК ДИНАМИЧЕСКИЕ ЯДЕРНЫЕ КОМПАРТМЕНТЫ
1.3. РОЛЬ ДИНАМИКИ ХРОМАТИНОВОЙ ФИБРИЛЛЫ В ПЕРЕМЕЩЕНИИ И ПОЗИЦИОНИРОВАНИИ ЭЛЕМЕНТОВ ГЕНОМА
1.3.1. ОБЩИЕ ПРИНЦИПЫ ОРГАНИЗАЦИИ ИНТЕРФАЗНОЙ ХРОМОСОМЫ. КОМПАРТМЕНТЫ. ДОМЕННАЯ ОРГАНИЗАЦИЯ
1.3.2. ТОПОЛОГИЧЕСКИ АССОЦИИРОВАННЫЕ ДОМЕНЫ
I.3.3 ФРАКТАЛЬНАЯ ГЛОБУЛА. ДИНАМИКА ХРОМАТИНОВОЙ ФИБРИЛЛЫ
I.4.ОРГАНИЗАЦИЯ ТРАНСКРИПЦИОННЫХ ФАБРИК/БЛОКОВ: ВЗГЛЯД ЧЕРЕЗ ОБЪЕКТИВ МИКРОСКОПА
ПОСТАНОВКА ЗАДАЧИ И МЕТОДИЧЕСКИЕ ПОДХОДЫ
II. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
II.1. МАТЕРИАЛЫ
II.1.1. КЛЕТОЧНЫЕ ЛИНИИ И ТКАНИ
II. 1.2.ХИМИЧЕСКИЕ РЕАКТИВЫ
11.1.3. ПРОГРАММНОЕ ОБЕСПЕЧЕНИЕ
11.2. МЕТОДЫ
11.2.1. РАБОТА С КЛЕТОЧНЫМ МАТЕРИАЛОМ
11.2.1.1 Ведение клеточных культур
11.2.1.2. Трансфекция клеток эукариот плазмидной ДНК
11.2.1.3 Получение гомогенных клеточных суспензий клеток мыши
11.2.2. ЗС-АНАЛИЗ
11.2.2.1. Фиксация клеток и изоляция ядер
11.2.2.2. Рестрикция и лигирование ДНК
11.2.2.3. Очистка продуктов лигирования
11.2.2.4. ПЦР в реальном времени с TaqMan-пробами
11.2.2.5. Приготовление эквимолярной смеси продуктов лигирования
11.2.3. 4С АНАЛИЗ
11.2.3.1. Рестрикция, лигирование и очистка ДНК
11.2.3.2. Амплификация фрагментов
11.2.3.3. Подготовка 4С-библиотек для секвенирования
11.2.3.4. Анализ 4С-данных
11.2.4. ПРОЦЕДУРА ChlPseq
11.2.5. ИММУНОЦИТОХИМИЯ
11.2.6. ФЛУОРЕСЦЕНТНАЯ ГИБРИДИЗАЦИЯ IN SITU
11.2.7. ЭЛЕКТРОННАЯ МИКРОСКОПИЯ
11.2.8. ИММУНОБЛОТТИНГ И ОКРАШИВАНИЕ КУМАСИ
III.РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ
ВВЕДЕНИЕ
111.1. ИЗУЧЕНИЕ СПЕКТРА ПОЛНОГЕНОМНЫХ ВЗАИМОДЕЙСТВИЙ ГЕНА ДОМАШНЕГО ХОЗЯЙСТВА NPRL3
III.1.1. ПРИНЦИП МЕТОДА 4С
III. 1.2 ПОДБОР РЕСТРИКТАЗ И ОЦЕНКА ЭФФЕКТИВНОСТИ РЕСТРИКЦИИ
III. 1.3. ПОДБОР ПРАЙМЕРОВ И СОЗДАНИЕ 4С БИБЛИОТЕК
111.1.4. АНАЛИЗ ДАННЫХ И СТАТИСТИЧЕСКАЯ ДОСТОВЕРНОСТЬ
111.1.5. ВЗАИМОДЕЙСТВИЕ ЯКОРНОГО ФРАГМЕНТА С УДАЛЕННЫМИ РЕГИОНАМИ, РАСПОЛОЖЕННЫМИ 14й ХРОМОСОМЕ И НА ДРУГИХ ХРОМОСОМАХ
111.1.6. КОРРЕЛЯЦИЯ ЧАСТОТЫ ВЗАИМОДЕЙСТВИЯ С ФУНКЦИОНАЛЬНО ЗНА ЧИМЫМИ МОТИВАМИ ГЕНОМА

Ш.1.7. АКТИВНЫЕ И НЕАКТИВНЫЕХРОМАТИНОВЫЕДОМЕНЫ РАЗДЕЛЕНЫ В ПРОСТРАНСТВЕ
III.1.8. НЕМЕТИЛИРОВАННЫЕ CPG-ОСТРОВКИ КЛАСТЕРИЗУЮТСЯ В ИНТЕРФАЗНОМ ЯДРЕ
III.2. ИССЛЕДОВАНИЕ МЕХАНИЗМОВ, ОБЕСПЕЧИВАЮЩИХ ПОДДЕРЖАНИЕ АКТИВАТОРНЫХ ХРОМАТИНОВЫХ БЛОКОВ. ИЗУЧЕНИЕ ОСОБЕННОСТЕЙ ПРОЦЕДУРЫ ЗС
111.2.1.ДНК НЕ СОЛЮБИЛИЗИРУЕТСЯ ПОСЛЕ ОБРАБОТКИ SDS И ЭНДОНУКЛЕАЗАМИ РЕСТРИКЦИИ
111.2.2.ЛИГИРОВАНИЕ ФРАГМЕНТОВ, ОБРАЗУЮЩИХ АКТИВАТОРНЫЙ ХРОМАТИНОВЫЙ БЛОК,
ПРОИСХОДИТ ПРЕИМУЩЕСТВЕННО В НЕРАСТВОРИМОЙ ФРАКЦИИ
III.1.3 НЕРАСТВОРИМАЯ ФРАКЦИЯ СОСТОИТ ИЗ НЕЛИЗИРОВАННЫХ ЯДЕР
1П.1.4.РАЗРУШЕНИЕ ОСТАТОЧНОГО ЯДРА ПРИВОДИТ К УМЕНЬШЕНИЮ ЗС-СИГНАЛА
IV-ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ
IV.1.ПЕРЕОСМЫСЛЕНИЕ ПРОЦЕДУРЫ ЗС И МОДЕЛЬ ЭКСПРЕССИОННОГО КОМПАРТМЕНТА
IV.2. АССОЦИАЦИЯ CPG-OCTPOBKQB ИГРАЕТ ВАЖНУЮ РОЛЬ В ПРОСТРАНСТВЕННОЙ ОРГАНИЗАЦИИ ИНТЕРФАЗНОГО ЯДРА
ЗАКЛЮЧЕНИЕ
ВЫВОДЫ
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

занимающие отдельные не перекрывающиеся друг с другом области ядерного пространства, получившие название хромосомных территорий (Foster and Bridger, 2005; Misteli, 2004; Pederson, 2004). Хромосомные территории - не просто способ компактной упаковки больших объемов хроматина в ограниченном ядерном пространстве, но и аппарат, наилучшим образом приспособленный для обеспечения слаженного функционирования генома. Динамичная структура хромосомных территорий обеспечивает доставку нужных генов к системам транскрипции, репарации и сплайсинга. Хромосомные территории разделены разветвленным интерхромосомным компартментом, который служит для транспорта РНК, различных предшественников и регуляторных белков и содержит факторы сплайсинга (Cremer et а!., 2000; Visa et al., 1993). Формирование хромосомных территорий было недавно подтверждено с помощью полногеномного Hi-C-анализа (Liebcrman-Aiden et al., 2009; Zhang et al., 2012). Последние исследования подтверждают наблюдения о закономерности расположения хромосом разных размеров в разной удаленности от центра ядра. Было показано, что маленькие, обогащенные генами хромосомы (16, 17, 19, 20, 21 и 22) располагаются в центре ядра и преимущественно взаимодействуют между собой. Только хромосома 18, маленькая, но бедная генами, не образует с ними большого числа контактов, что согласуется с данными FISH, свидетельствующими о ее расположении на периферии ядра.
Из этих и других наблюдений становится понятно, что хроматин,
располагающийся на периферии ядра, обладает несколько иными свойствами,
нежели хроматин, который занимает центральную область ядра. Протяженные (0
10 Mb) области неактивного гетерохроматина, ассоциированные с сетчатой