Биосенсоры активных форм кислорода и других редокс-активных соединений : создание и применение в живых системах

• Автор: Белоусов, Всеволод Вадимович
• Шифр специальности: 03.01.03
• Научная степень: Докторская
• Год защиты: 2013
• Место защиты: Москва
• Количество страниц: 268 с. : ил.

Оглавление
Введение
Обзор литературы
Компартментализация передачи сигналов, опосредованных активными
формами кислорода
Источники АФК: НАДФН оксидазы
Источники АФК: митохондрии
Методы детекции АФК
Генетически кодируемые флуоресцентные индикаторы
Цель работы
Материалы и методы
Результаты
Создание генетически кодируемого флуоресцентного индикатора для
детекции пероксида водорода
НуРег-2, сенсор Н202 с увеличенным динамическим диапазоном
НуРег-3: Сочетание преимуществ НуРег и НуРег-2
Исследование микродоменов пероксида водорода с помощью
локализованных сенсоров
Создание двойного биосенсора для одновременной детекции
фосфатидилинозитол-(3,4,5)-трифосфата (Р1РЗ) и пероксида водорода Исследование динамики и функции Н202 при фагоцитозе
Создание красного флуоресцентного белка НуРег-ЯЕО
Генетически кодируемый сенсор для детекции соотношения НАД+/НАДН 171 Обсуждение
Выводы
Заключение
СПИСОК ПУБЛИКАЦИЙ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ
Список сокращений
Благодарности
Список цитируемой литературы

Введение
Кислород является центральной молекулой для аэробных форм жизни Кислород служит не только терминальным акцептором электронов в дыхательных цепях, но и регулятором большого числа метаболических и сигнальных процессов в живых системах. Поток электронов от субстратов к акцепторам проходит через редокс-пары активных соединений. Некоторые из этих редокс-пар также играют роль глобальных регуляторов жизнедеятельности живых систем.
Многие процессы в клетках регулируются кислородом не непосредственно, а через его активные формы. Активные формы кислорода (АФК) синтезируются в клетке как спонтанно, в результате утечки электронов в дыхательных цепях, так и направленно, в результате функционирования специализированных ферментативных систем. Ввиду крайне высокой реакционной способности АФК, их синтез и распространение строго контролируется клеткой. Нарушение контроля ведет к неспецифическому повреждению биологических макромолекул и аберрантной активации сигнальных каскадов: состоянию, известному как «окислительный стресс». Окислительный стресс прочно ассоциирован с развитием огромного числа патологий: нейродегенеративных заболеваний, патологий сердечно-сосудистой системы, нарушений иммунитета и др. Не удивительно, что активные формы кислорода, их синтез, распространение и утилизация являются центральными объектами исследований сотен лабораторий медико-биологического профиля во всем мире.
Вместе с тем, на протяжении нескольких десятилетий, с момента открытия АФК в живых системах по настоящее время, отсутствовали методы, позволяющие детектировать АФК в живых системах в режиме реального времени. С одной стороны, большое количество красителей, люминесцентных соединений и электродов позволяло количественно и специфично детектировать АФК in vitro в изолированных препаратах ферментов и органелл, в различных гомогенатах и субклеточных фракциях. С другой стороны, внутриклеточные флуоресцентные красители на основе синтетических хромофоров не обладали достаточной специфичностью к определенным формам АФК и в основном отражали протекание неких окислительно-восстановительных сигналов в клетке

Кроме того, из-за фотодинамического эффекта эти красители сами генерировали АФК при облучении видимым светом в процессе микроскопии. Другим существенным недостатком синтетических красителей является их необратимость и невозможность их адресной доставки к субклеточным структурам.
В то время как красители для детекции АФК были несовершенны, но широко применялись за неимением лучших методов, детекция состояния других ключевых редокс-пар, таких как НАД+/НАДН, in vivo была вообще невозможна. Все это послужило поводом к созданию нами методической платформы для детекции редокс-активных соединений, основанной на генетически кодируемых флуоресцентных индикаторах. Настоящая работа посвящена созданию таких сенсоров, их усовершенствованию и, наконец, применению для ответов на ключевые вопросы редокс-биологии: где и когда образуются АФК в живых системах?
1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ
Биологии и химии активных форм кислорода и свободных радикалов посвящено огромное количество литературных источников Поэтому в настоящем обзоре мы не пытались классифицировать многочисленные АФК, их реакции и источники. Вместо этого мы попытались сосредоточить внимание на сравнительно новых аспектах биохимии АФК, в первую очередь на пространственно-временной локализации продукции АФК в клетках. Именно компартментализация АФК наделяет некоторые из них функцией молекул-мессенджеров. Нам также показалось важным подробно рассмотреть НАДФН-оксидазы, как основные физиологические продуценты супероксида и Н202 Именно белки этого семейства генерируют Н202 в изучаемых нами в рамках данной работы системах. Традиционные представления об АФК в клетке рассматривали митохондрии как главный источник оксидантов в клетке. Мы коротко рассмотрим взаимоотношения АФК и митохондрий в одном из разделов обзора. Наконец, данная работа посвящена разработке новых методов детекции редокс-активных соединений. Мы сочли необходимым дать читателю

Nox2 локализован на мембране фагосом у нейтрофилов и в кавеолах на лидирующем крае ламеллиподий эндотелиальных клеток [46]. Nox2 также был найден на мембране эндосом [68], включая редоксисомы - эндосомы в нефагоцитирующих клетках, ответственные за раннюю сигнализацию, опосредованную рецептором [16, 46, 68].
Внутриклеточная передача сигнала
В нейтрофилах интенсивно изучалось участие Nox2 во внутриклеточной передаче сигнала. Nox2, локализованный на мембране фагосом, активируется в присутствии микробов и цитокинов и продуцирует Ог" . Супероксид в фагосоме дисмутирует в Н202, который, взаимодействуя с ионами хлорида при участии миелопероксидазы (МРО), превращается в гипохлорит. Гипохлорит является эффективным антимикробным окислителем Такой путь имеет четкое физиологическое значение в иммунной защите. Известно, что пациенты, не имеющие Nox2, или имеющие мутации в других необходимых компонентах нейтрофильной НАДФН-оксидазы страдают хроническим гранулематозом и сильно восприимчивы к инфекции [153, 154].
Продукция АФК в фагосомах является не единственной ролью Nox2 даже в контексте иммунной защиты. В нейтрофилах многочисленные цитокины активируют продукцию АФК, которые затем инактивируют тирозиновые фосфатазы [155], что приводит к перестройке цитоскелета и другим эффектам [156]. В макрофагах АФК, производимые Nox2, также вовлечены в апоптоз, так как активируют ASKl-p38 MAP-киназный путь [157]
В других типах клеток Nox2 участвует в каскадах фосфорилирования-дефосфорилирования по аналогии с Noxl (Рис. 6). Например, исследования в фибробастах показали, что Nox2 в эндосомах участвует в активации транскрипционного фактора NFkB, вызванной TNFa [158]. Авторы статьи предполагают, что как только рецептор TNFa активируется и интернализуется, к рецептору привлекается TRADD. АФК, продуцируемые Nox2, способствуют связыванию TRAF2 с комплексом TNFR1 /'TRADD, который затем активирует киназу IkB (IKK), что способствует активации NF-кВ. Этот путь, вероятно, способствует клеточной смерти, так как клетки линии MEF дефицитные по TRAF2 устойчивы к клеточной смерти, индуцируемой АФК [159, 160].