Красные и дальне-красные флуоресцентные белки, оптимизированные для мечения белков слияния

• Автор: Шемякина, Ирина Игоревна
• Шифр специальности: 03.01.03
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2015
• Место защиты: Москва
• Количество страниц: 101 с. : ил.

Содержание
Содержание
Введение

Список сокращений

1. Обзор литературы

1.1. История открытия флуоресцентных белков

1.2. Характеристика GFP: структура и свойства

1.3 Биологическая функция флуоресцентных белков

1.4 Применение флуоресцентных белков

1.5 Проблема олигомеризации флуоресцентных белков

1.6 Мономерные флуоресцентные белки
1.7 Заключение
2. Материалы и методы
2.1 Оборудование и реактивы
2.1.1 Оборудование
2.1.2 Реактивы
2.1.3 Буферные растворы
2.1.4 Микробиологические среды
2.1.5 Бактериальные штаммы и клеточные линии
2.2 Методы исследования и анализа результатов
2.2.1 Амплификация фрагментов ДНК
2.2.2. Случайный [Random) мутагенез
2.2.3. Сайт-специфический мутагенез
2.2.4. Трансформация клеток E. Coli

2.2.5. Выделение плазмидной ДНК
2.2.6. Переосаждение ДНК
2.2.7. Определение нуклеотидной последовательности ДНК
2.2.8 Выделение и очистка рекомбинантных белков
2.2.9 Определение скорости созревания хромофора
2.2.10 Гель-фильтрация
2.2.11 Спектроскопические методы
2.2.12. Трансфекция эукариотических клеток
2.2.13 Микроскопия
2.2.14 Получение рекомбинантных конструкций
2.2.14.1 Получение бактериальных экспрессионных векторов
2.2.14.2 Получение эукариотических экспрессионных векторов
2.2.14.3 Получение FusionRed
2.2.14.4 Получение mKateKFPl и mKateKFP
2.2.14.5 Получение FusionRed-
2.2.15 Трансгенные Хепорus laevis
3. Результаты и обсуждение
3.1 Красный мономерный флуоресцентный белок
3.1.1 Получение белка FusionRed
3.1.2 Характеристика и сравнение FusionRed с аналогами in vitro.
3.1.3 Характеристика и сравнение белка FusionRed с аналогами in vivo
3.2. Красные мономерные обратимо фотоактивируемые белки
3.2.1 Получение белков mKateKFPl и mKateKFP

3.2.2 Изучение фотоактивационных свойств белков тКа!еКРР1 и тКа1еКРР
3.3. Дальне-красный мономерный белок
3.3.1 Получение дальне-красного мономерного белка
3.4 Заключение
Выводы
Список литературы

1.7 Заключение
Таким образом, сегодня палитра мономерных флуоресцентных белков позволяет проводить эксперименты по многоцветовому мечению, что открывает новые возможности для отображения сложных структур и процессов в живых системах [см. рис. 5)
В красной области спектра лучшими образцами являются белки mCherry, TagRFP и mKate2. Эти белки хорошо работают в составе единых химерных конструкций с большинством исследуемых белков. Однако в случае ряда чувствительных клеточных белков химерные молекулы с mCherry, TagRFP и mKate2 имеют нарушенную локализацию и функцию, в то время как аналогичные конструкции с использованием природных зеленых мономеров (таких как EGFP) хорошо проявляют себя в работе.
Эти проблемы объясняются остаточной слабой димеризацией красных флуоресцентных белков, которую можно детектировать in vitro, например, методами высокоэффективной жидкостной хроматографии (HPLC), а также склонностью этих белков к неспецифическим взаимодействиям и агрегации в составе химерных конструкций при мечении белков слияния в живых клетках.
Таким образом, по прежнему актуальной задачей является получение красных и дальне-красных ФБ, оптимальных для мечения клеточных белков. Такие белки должны сохранять мономерные свойства даже при высоких концентрациях (более 1 мг/мл}, не должны быть склонным к неспецифичным взаимодействиям в живых клетках, не должны проявлять цитотоксических свойств, и при этом должны отличаться высокой яркостью, pH- и фотостабильностью, и достаточно высокой скоростью созревания хромофора.