Структура и генетика биосинтеза О-антигенов энтеробактерий рода Providencia

• Автор: Овчинникова, Ольга Геннадьевна
• Шифр специальности: 02.00.10, 03.01.03
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2013
• Место защиты: Москва
• Количество страниц: 164 с. : ил.

СОДЕРЖАНИЕ
1 ВВЕДЕНИЕ
2 ЛИТЕРАТУРНЫЙ ОБЗОР
Биосинтез липополисахаридов грамотрицательных бактерий
2.1 Общая характеристика липополисахарида
2.2 Биосинтез нуклеотидных предшественников сахаров
2.3 Биосинтез кора-липида А
2.4 Биосинтез О-антигена
2.5 Лигирование и экспорт липополисахарида на внешнюю мембрану
3 РЕЗУЛЬТАТЫ
3.1 Классификация бактерий рода Ргохгёепаа
3.2 Установление строения О-полисахаридов бактерий Ргохчёепс'ш
3.2.1 Общие подходы к структурному анализу О-полисахаридов
3.2.2 Строение О-полисахаридов различных О-серогрупп
3.3 Характеристика генных кластеров О-антигенов Ргоч(1епс'ш
3.3.1 Локализация и организация генных кластеров О-антигенов
3.3.2 Функциональный анализ генов т зШсо
3.3.3 Биохимическое подтверждение функций генов биосинтеза ООР-колитозы
4 ОБСУЖДЕНИЕ
4.1 Особенности состава и строения О-антигенов РгоУ1с1епаа
4.2 Серологические взаимосвязи О-антигенов РгоУ1(1епаа и других бактерий
4.3 Генетика биосинтеза О-антигенов ЕятТ/еис/а
5 ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ
5.1 Бактериальные штаммы и выращивание бактерий
5.2 Выделение и деградация липополисахаридов
5.3 Химические и физические методы
5.4 Генетические и биохимические методы
ВЫВОДЫ
УСЛОВНЫЕ ОБОЗНАЧЕНИЯ
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ
ПРИЛОЖЕНИЕ А Данные спектров ЯМР
ПРИЛОЖЕНИЕ Б Характеристика генов

1 ВВЕДЕНИЕ
Соматические О-антигены наряду с капсульными К-антигенами и жгутиковыми Н-антигенами представляют собой три основных типа биомолекул, на которых традиционно основывается серологическая классификация и идентификация грамотрицательных бактерий. С химической точки зрения О-антиген или О-специфический полисахарид (О-полисахарид) представляет собой полисахаридную цепь Б-формы липополисахарида (ЛПС). Липидная часть ЛПС (липид А) образует внешний слой бислойной наружной мембраны клеточной стенки и удерживает молекулу ЛПС на поверхности клетки за счет гидрофобных взаимодействий с фосфолипидами, образующими внутренний слой мембраны. Липид А также отвечает за большинство биологических активностей ЛПС, в том числе за его узнавание специфическими клеточными рецепторами иммунной системы хозяина, служащее сигналом для включения защитных механизмов врожденного иммунитета. О-Полисахарид обычно построен из повторяющихся олигосахаридных единиц (О-звеньев) и присоединяется к липиду А через олигосахарид, называемый кором. Он ориентирован в сторону окружающей среды и несет на себе иммунодетерминанты (эпитопы), которые являются сайтами связывания для специфических антител, вырабатываемых иммунной системой в ответ на инфекцию и необходимых для эффективного фагоцитоза. В ходе эволюции сформировалось широкое структурное разнообразие О-антигенных форм даже у бактерий одного вида, что, как полагают, способствует адаптации бактерий в различных экологических нишах, а также помогает патогенам избегать адаптивного иммунитета организма-хозяина. Иммуноспецифичность и вариабельность О-антигенов служат основой для разработки серологических классификаций медицински значимых микроорганизмов, востребованных при серодиагностике бактериальных инфекций и эпидемиологическом мониторинге. В этих классификациях серологически идентичные штаммы одного вида или нескольких близкородственных видов бактерий объединены в О-серогруппы.
В последнее время активно развиваются методы молекулярного типирования бактерий, такие как полимеразная цепная реакция и технология на основе микрочипов. На генетическом уровне различия между структурами О-полисахаридов бактериальных клонов обусловлены полиморфизмом генного кластера О-антигена (ГКО) - определенного локуса генома, отвечающего за биосинтез О-антигена. Секвенирование и последующий анализ ГКО позволяют выявлять гены, специфичные для каждой О-серогруппы, и использовать их в качестве специфических маркеров для молекулярного типирования штаммов. Функциональный анализ генов, участвующих в сборке и полимеризации О-звеньев, имеет практическое значение для разработки биотехнологических подходов к получению гликовакцин нового поколения, в которых требуемые фрагменты О-полисахаридов частично

или полностью продуцируются in vivo. Структурно-генетические исследования О-антигенов ставят своей целью также ряд фундаментальных задач, таких как изучение молекулярных и. механистических основ биосинтеза гликоконьюгатов и выяснение эволюционных путей формирования разнообразия О-антигенных форм.
Настоящая работа посвящена установлению строения О-полисахаридов и характеристике ГКО представителей рода Providentia семейства энтеробактерий (Enterobacteriaceae). Провиденсии широко распространены в природе. Они обитают в почве, сточных водах и загрязненных водоемах; их также выделяют из большого круга живых организмов по всему миру от насекомых до акул, морских черепах и пингвинов. Бактерии Providentia составляют часть нормальной микрофлоры кишечника человека, но в то же время они являются условными патогенами, вызывая у людей с ослабленным иммунитетом воспаления мочеполовых путей, раневые инфекции и кишечные заболевания. Нередко они становятся причиной внутрибольничных инфекций.
Объектом настоящей работы стали три наиболее важных в медицинском отношении вида Providentia - Р. alcalifaciens, Р. stuartii и Р. rnstigianii. Начиная с конца 1990-х годов, систематическое химическое и иммунохимическое изучение ЛПС этих бактерий проводится в лаборатории химии углеводов ИОХ РАН совместно с Институтом микробиологии, биотехнологии и иммунологии Университета Лодзи (Польша). Оно ставит своей основной целью создание молекулярной основы для классификации провиденсий. Объединенная серологическая классификация рассматриваемых трех видов Providentia включает 63 О-серогруппы, из которых к началу нашей работы в отношении строения О-полисахаридов были изучены 13 О-серогрупп. В ходе данного исследования установлены структуры О-антигенов еще 23 О-серогрупп. Наряду с распространенными компонентами бактериальных полисахаридов, в их составе, обнаружены и идентифицированы производные моносахаридов, редко встречающиеся в природных гликополимерах или найденные впервые. Выявлена корреляция структурных данных с иммуноспецифичностью О-антигенов, что позволило обосновать на молекулярном уровне серологическое родство внутри рода Providentia и между штаммами этого и других родов энтеробактерий (Proteus, Escherichia, Salmonella).
Еще одной целью работы было изучение генетики биосинтеза О-антигенов Providentia, первым этапом которого стал поиск ГКО в полногеномных последовательностях штаммов трех видов Providentia, имеющихся в доступной базе генетических данных. Локализация полиморфного ГКО на хромосоме между консервативными генами «домашнего хозяйства» срхА и yibK дала возможность разработать праймеры и провести секвенирование области cpxA-yibK в штаммах 8 О-серогрупп. Биоинформатический анализ на основе гомологии предсказанных аминокислотных последовательностей и с учетом полученных данных о

переносится на праймер UndPP-GlcNAc гликозилтрансферазой WbbE. Вторая гликозилтрансфераза WbbF принадлежит к семейству гиалуронансинтаз и предположительно осуществляет дальнейший рост цепи. Синтазы являются интегральными мембранными белками, которые катализируют как полимеризацию, так и одновременную транслокацию образующегося полисахарида через внутреннюю мембрану [103]. Точные механизмы действия WbbF и терминирования полимеризации не известны. Синтаза S. enterica 054, как и другие белки этого семейства, участвующие в биосинтезе целлюлозы, хитина, гиалуронана, альгината, КПС S. pneumoniae и nonn(ß-D-GlcNAc), характеризуются наличием двух консервативных доменов, один из которых, вероятно, участвует в создании гликозидной связи,-а другой -в транспорте образующегося полимера [87].
Wzk-зависимый путь открыт недавно в Я. pylori [80] и пока не обнаружен в других бактериях. Для Я. pylori характерна молекулярная мимикрия за счет экспрессии углеводных детерминант секреторных антигенов Льюиса на невосстанавливающем конце О-антигена, представляющего собой фукозилированный поли(Я-ацетил-Р-лактозамин) [69]. Гены биосинтеза О-антигена Я. pylori не кластеризованы, а разбросаны по хромосоме. Синтез О-антигена инициируется образованием UndPP-GlcNAc, на который соответствующие гликозилтрансферазы поочередно переносят остатки Gal и GlcNAc, а фукозилтрансферазы присоединяют боковые остатки Fuc. Уникальная для О-антигенов флиппаза Wzk является гомологом флиппаз, участвующих в N-гликозилировании бактериальных белков. Ее роль заключается в транспорте готового UndPP-связанного полисахарида через внутреннюю мембрану. Wzk не специфична к структуре О-полисахарида и может переносить различные гликаны. Так, экспрессия Wzk в Avi'zx-мутанте E. coli восстанавливает функцию экспорта О-звена. Отсутствие у Wzk жестких структурных требований к субстрату позволяет Я. pylori варьировать структуру антигенных детерминант, подстраиваясь под тип антигенов Льюиса хозяина.
2.4.5 Пост-транслокационные модификации О-антигена
Независимо от механизма биосинтеза, О-звено или О-полисахарид после транспорта через внутреннюю мембрану могут подвергаться структурным модификациям в периплазматическом пространстве. Одним из наиболее изученных примеров такого рода является конверсия О-серотипов Shigella flexneri - возбудителя шигеллеза. Она существенно увеличивает разнообразие О-антигенных структур на клеточной поверхности, позволяя бактериям избегать защитного действия приобретенного иммунитета.
О-Антигены всех известных 19 серотипов S. flexneri, за исключением серотипа 6, имеют одинаковый углеводный скелет с линейным тетрасахаридным О-звеном, который