Разработка и применение ПЦР-технологий для молекулярно-генетической диагностики герпесвирусов

• Автор: Евсегнеева, Жанна Витальевна
• Шифр специальности: 14.03.10
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2012
• Место защиты: Москва
• Количество страниц: 118 с. : ил.

ОГЛАВЛЕНИЕ
ИСПОЛЬЗОВАННЫЕ СОКРАЩЕНИЯ
ВВЕДЕНИЕ
ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ
Глава 1. Характеристика герпесвирусов человека и основных клинических проявлений инфекции
1.1. Структура и организация вирусного генома
1.2. Репродукция вирусных частиц
1.3. Основные клинические формы герпесвирусных инфекций
1.4. Герпесвирусные инфекции в неонатологии и педиатрии 21 Глава 2. Методы лабораторной диагностики герпесвирусной инфекции
2.1. Электронная микроскопия
2.2. Цитологический метод
2.3. Серологические методы
2.3.1. Иммунофлюоресцентный метод
2.3.2. Иммуноферментный метод
2.4. Вирусологический метод
2.5. Молекулярно-биологические методы
2.5.1. Мультипраймерная ПЦР
2.5.2. ПЦР в режиме реального времени
2.5.3. ПЦР in situ
2.6. Заключение 36 СОБСТВЕННЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ
Глава 3. Материалы и методы исследования
3.1. Быстрый культуральный метод
3.2. Серологические методы диагностики
3.2.1. Твердофазный иммуноферментный анализ
3.2.2. Авидность антител
3.2.3. Реакция иммунопреципитации
3.3. Молекулярно-генетические методы
3.3.1. Полимеразная цепная реакция
3.3.2. Проведение мультипраймерной ПЦР

3.3.3. Проведение ПЦР в режиме реального времени
3.3.4. Проведение ПЦР in situ
3.4. Статистическая обработка данных
Глава 4. Результаты и обсуждение исследований
4.1. Разработка и сравнительный анализ молекулярно-генетических методов диагностики герпесвирусов
4.1.1. Мультипраймерная ПЦР
4.1.2. Сравнение методов пробоподготовки и эффективности выделения нуклеиновых кислот из различных клинических образцов
4.1.3. ПЦР в режиме реального времени
4.1.4. Модифицированный методом ПЦР in situ
4.1.4.1. Выявление ДНК вируса простого герпеса методом
ПЦР in situ
4.1.4.2. Сравнительный анализ выявления вируса простого герпеса и цитомегалоаируса в материалах аутопсии
4.2. Выявление прямых и серологических маркеров вируса простого герпеса и цитомегалоаируса у новорожденных детей с подозрением на внутриутробную инфекцию
4.2.1. Сравнительный анализ методов диагностики прямых маркеров вируса простого герпеса и цитомегалоаируса у новорожденных детей с подозрением на внутриутробную инфекцию
4.2.2. Динамика выявления прямых маркеров вируса простого герпеса и цитомегаловируса у новорожденных детей в течение первого года жизни
4.2.3. Изучение параметров гуморального иммунитета у новорожденных детей в сыворотке крови серологическими методами
4.3. Разработка алгоритма лабораторной диагностики врожденной цитомегаловирусной инфекции у детей с клиническими признаками внутриутробного инфицирования
4.3.1. Определение прямых и серологических маркеров цитомегаловирусной инфекции у детей в неонатальном периоде

4.3.1.1. Частота выявления цитомегаловируса у новорожденных детей разных групп исследования на первых неделях жизни ПЦР и быстрым культуральным методом
4.3.1.2. Сравнительный анализ выявления цитомегаловируса у обследованных новорожденных детей на первых неделях жизни быстрым культуральным методом
4.3.1.3. Изучение показателей иммунитета у новорожденных детей разных групп на первых неделях жизни
4.3.2. Частота выявления цитомегаловируса у новорожденных детей на протяжении первого года жизни
4.3.2.1. Сравнительный анализ частоты выявления прямых маркеров цитомегаловируса в различных клинических образцах
4.3.2.2. Сравнительный анализ частоты выявления цитомегаловируса в клинических образцах методом ПЦР и быстрым культуральным методом
4.3.2.3. Изучение прямых маркеров цитомегаловируса у недоношенных новорожденных детей с внутриутробным инфицированием в динамике
4.3.2.4. Сравнительный анализ выявления маркеров цитомегаловируса серологическими и прямыми методами у недоношенных новорожденных детей с внутриутробным инфицированием на протяжении первого года жизни
4.4. Сравнительный анализ диагностики герпесвирусов с использованием ПЦР и быстрого культурального метода
4.4.1. Сравнительный анализ эффективности ПЦР и быстрого культурального метода при исследовании цельной крови новорожденных детей на присутствие вируса простого герпеса 1 и 2 типов
4.4.2. Сравнительный анализ чувствительности выявления вируса простого герпеса в культуре клеток двумя лабораторными методами - ПЦР и быстрым культуральным методом
ВЫВОДЫ
ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

Другим способом является использование ферментов, например, пероксидазы хрена или щелочной фосфатазы. Ферменты подвергают химическому связыванию с синтетическими олигонуклеотидами что делает возможным их последующее обнаружение с помощью реакции ферментативной преципитации. Использование таких непрямых систем обнаружения помогает избежать нежелательного фонового сигнала. Визуализацию специфической метки проводят с помощью микроскопии.
ПЦР in situ обладает определенными недостатками: более жесткая предварительная обработка срезов и резкие многократные температурные перепады на этапе амплификации нередко приводят к разрушению срезов, а также возможность побочных реакций, приводящих к регистрации ложноположительных сигналов. К методическим сложностям метода можно отнести его многоэтапность и трудоемкость. В связи с этим были проведены работы, посвященные оптимизации и усовершенствованию ПЦР in situ, которые увеличивают чувствительность и уменьшают количество неспецифических продуктов реакции. При проведении амплификации in situ исследователи рекомендуют изменение соотношения смеси ПЦР реактивов [154]: увеличение концентрации Mg2+ в реакционной смеси; увеличение количества ДНК-полимеразы. Во избежание испарения реакционной смеси срез накрывают покровным стеклом.
Наиболее яркими примерами использования метода ПЦР in situ является результаты изучения нервной ткани больных новорожденных детей. Энцефалиты, как полагают, являются основным заболеванием ЦНС у новорождённых детей. Постановка диагноза основана на результатах гистологического обследования. Роль ВПГ в развитии патологических изменений в тканях мозга у новорождённых до конца не определена. Доказательств вирусной локализации в нервной системе и гистологических изменений нервной ткани, вызванных ВПГ, недостаточно. Поэтому использование метода ПЦР in situ в решении этих вопросов весьма целесообразно, кроме того данный метод может помочь в установлении