Новая стратегия пептидного дизайна на примере создания оригинальных ноотропов и нейролептиков

• Автор: Гудашева, Татьяна Александровна
• Шифр специальности: 14.00.25
• Научная степень: Докторская
• Год защиты: 1998
• Место защиты: Москва
• Количество страниц: 71 с. : ил.; 20х15 см

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ
Актуальность проблемы.
Различают два основных этапа в создании нового потенциального лекарственного средства: открытие новой группы биологически активных химических соединений и оптимизация оригинальных соединений внутри этой группы по активности, специфичности, биодоступности и токсичности.
В то время как методы оптимизации уже найденной фармакологически активной структуры хорошо разработаны (например, QSAR, Quantitative Structure-Activity Relationship), открытие новых химических групп биологически активных соединений остается наиболее трудной и дорогостоящей задачей. Ведущие фармакологические фирмы США тратят около 15 млрд. долларов в год на разработку и производство лекарственных препаратов, причем 7-9 млрд. долларов из этой суммы расходуется на открытие новых химических групп, обладающих специфической фармакологической активностью (Martin Y.C., 1991).
Большинство классических психотропных средств было открыто клиницистами или фармакологами эвристическим путем или методами традиционного скрининга. Так, например, бутирофеноновые нейролептики были открыты случайно при изучении этих соединений как аналогов центрально активного анальгетика петидина. Имипрамин как родоначальник трициклических антидепрессантов и пирацетам как первый представитель пирролидоновых ноотропов были открыты эвристическим путем клиницистами. Хлордиазепоксид как первое соединение из ряда бензодиазепиновых транквилизаторов и хлррпромазин как первый фенотиазиновый нейролептик были открыты с помощью целенаправленного фармакологического скрининга. Скрининг и по сей день остается важнейшим методом выявления новых биологически активных структур.
В последние годы активно развивается новое направление скрининга, использующее зкнантные рандомизированные пептидные библиотеки (Bull А.Т. et al., 1992),
i-me синтетические библиотеки (Pavia M.R. et al.,1993, Gallop M. et al., 1994, Gordon

al., 1994)) и массовые биохимические методы определения биологической
... к, позволяющие тестировать тысячи соединений в относительно короткое время, ; s яаномолярные количества веществ. В основном используются иммунохимические, « .еские и рецепторные методы тестирования. Положительной стороной такого
подхода является высокая степень автоматизации исследований, однако, его недостатком является сложность использования поведенческих и других системных методов тестирования фармакологической активности и невозможность поиска лекарственных средств для патологических состояний, молекулярный механизм которых неизвестен.
Современные подходы к рациональному поиску новых биологически активных структур основаны на понимании фундаментальных принципов молекулярного распознавания. Успех в этой области связан с развитием, с одной стороны, молекулярной биологии, а с другой- компьютерного молекулярного моделирования.
В последние 5-7 лет с развитием компьютерной техники и появлением информации о трехмерной структуре значительного числа ферментов и некоторых рецепторов появились такие методы поиска принципиально новой структуры лиганда, как молекулярный докинг (docking) (Shoichet В.К. et al., 1993, Aqvist J. et al, 1994). Докинг представляет собой компьютерный метод отбора структур, комплементарных зоне связывания белка-акцептора. Существует несколько вариаций этого метода - геометрический докинг, гидрофобный докинг и т.д. (Vakser I.A. 1996, Librand, 1995, Ajay, 1995, McMartin С.,1997). При этом новая структура лиганда или имеется в библиотеке соединений, или должна бьпъ синтезирована de novo.
Трехмерную структуру рецептора для докинга получают методом рентгеноструктурного анализа после очистки и кристаллизации рецептора, причем, благодаря развитию рентгеноструктурного анализа, лимитирующей стадией является как раз очистка и кристаллизация. Чаще используют гипотетическую трехмерную модель рецептора, исходя из его первичной структуры и трехмерной структуры белков-гомологов. Однако, такая модель является неточной, что заставляет создавать и использовать наборы так называемых «топографических ограничителей», то есть близких по структуре и методам синтеза молекул, позволяющих варьировать расстояние между ключевыми точками центров связывания. Созданные с помощью «топографических ограничителей» (частным случаем которых являются имитаторы p-поворотных пептидных структур, Kieber-Emmons Т. et al., 1997) молекулы также представляют собой родоначальники новых физиологически активных групп соединений. Отметим, что мощный поток информации о первичных структурах белков идет благодаря программе «геном человека», обещающей к 2003 году расшифровку всех 100 ООО генов человеческого генома. Информация о трехмерных структурах белков аккумулируется в компьютерном банке данных PDB (Protein Data Bank,

содержание цикло-пролилглицина в плазме крови, рассчитанное по плошади соответствующего пика, увеличилось в 1,5 раза, а в присутствии мембран мозга- в 5 раз по сравнению с контролем. Эти эксперименты подтверждали образование цикло-пролилглицина из ГВС-111 в физиологических условиях. Обнаружение в контрольных образцах экстракта мозга пика, совпадающего по времени удерживания с синтетическим шжло-пролилглицином могло означать существование эндогенного циклонейропептида цикло-пролилглицина.
2.4.2. Обнаружение специфических мест связывания [3Н] этилового эфира Ы-фенилацетилпролгмглицина в мозгу крыс.
Сравнение спектра ноотропной активности ГВС-111 и его биологически акшвного метаболита цикло-пролилглицина показывает, что они совпадают не полностью: ГВС-111 облегчает все фазы памяти (ввод информации, консолидацию и извлечение памятного следа), тогда как цикло-пролилглицин облегчает ввод информации, не влияет на консолидацию и ингибирует извлечение информации из памяти (табл. 10). Можно предположить, что наряду с действием через свой основной биологически активный метаболит, ГВС-111 воздействует на память и по другому механизму, возможно, путем взаимодействия нерасщепленной молекулы этилового эфира Н-фенилацетилпролилглицина с какими-то другими рецепторами. В связи с этим была проведена работа по обнаружению специфических мест связывания [3Н] этилового эфира Ы-фенилацетилпролилглицина в мембранах мозга крыс.
Было показано, что связывание [3Н]ГВС-111 с общими мембранами мозга является насыщаемым и обратимым (рис. 4). Мембраны мозга, денатурированные кипячением, не давали специфического связывания ГВС-111 (табл. 9) Это свидетельствовало о белковой природе мест связывания. Специфическое связывание было стереоселективным: 1>-энантиомер ГВС-111 не вытеснял [3Н]ГВС-111, что согласуется с фармакологическими данными об отсутствии ноотропной активности у ЕЗ-энантиомера Скетчард-анализ кривой вытеснения меченого ГВС-111, взятого в концентрации 10 нМ, холодным ГВС-111 на свежих мембранах в интервале концентраций 10'9-10‘3М выявил специфические места связывания ЩГВС-! 11 двух типов: высокоаффинные с 10=6,85* ЮМ и 8= 1,6 пмоль/мг белка и низкоаффинные с 10=7.69*104 и Втач= 73,2 пмоль/мг белка. На замороженных мембранах высокоаффинные места связывания не обнаруживались.