Клетки целомического эпителия морской звезды Asterias rubens L., обладающие свойствами стволовых клеток

• Автор: Шарлаимова, Наталья Сергеевна
• Шифр специальности: 03.03.04
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2011
• Место защиты: Санкт-Петербург
• Количество страниц: 155 с. : ил.

ОГЛАВЛЕНИЕ
ВВЕДЕНИЕ,
1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ
1.1.. Общие замечания
1.2. Краткое описание объекта исследования
1.3. Регенеративный потенциал у иглокожих
1.4. Экспериментальные модели регенерации на примере
иглокожих
1.5. Вопрос о происхождении целомоцитов
1.6. Целомоциты (ЦЦ) - клетки целомической жидкости (ЦЖ)
1.7. Роль ЦЦ в регенеративных процессах
1.8. Характеристики стволовых клеток
1.9. Культивирование клеток морских беспозвоночных
2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
2.1. Объект исследования
2.2. Условия травмирования животных
2.3. Выделение суспензий клеток ЦЖ, ЦЭ, а также субпопуляции
клеток, слабо связанных с ЦЭ (ЦЭ-с),
2.4. Анализ пролиферативной активности клеток in vivo
2.5. Окраска препаратов антителами
2.6. Антитела, используемые для непрямой иммунофлуоресценции
2.7. Гистологический анализ суспензий клеток ЦЖ, ЦЭ и ЦЭ-с
2.8. Визуализация мембраны малых клеток после окраски
суспензий клеток ЦЭ и ЦЭ-с мембранным красителем DIL
2.9. Анализ белкового состава суспензий клеток ЦЖ, ЦЭ и ЦЭ-с
2.10. Анализ возможности миграции клеток ЦЭ-с из состава ЦЭ,
2.11. Анализ суспензий клеток методом проточной
цитофлуориметрии
2.12. Определение локализации малых клеток в составе ЦЭ,

2.12.1. Приготовление и окраска полутонких срезов
метиленовым синим
2.12.2. Приготовление и окраска тотальных препаратов
whole-mount антителами к тубулину и DAPI
2.13. Культивирование клеток ЦЖ, ЦЭ и ЦЭ-с
2.14. Анализ пролиферативной активности клеток в культуре
2.15. Выбор субстрата для культивирования
2.15.1. Нанесение лигандов на стекла
2.15.2. Распластывание клеток на различных субстратах,
окраска препаратов родамин-фаллоидином и DAPI
2.15.3. Оценка среднего количества клеток, прикрепившихся к разным подложкам и классификация
прикрепленных и распластанных клеток
2.16. Культивирование клеток ЦЭ на ламиинине (Лм)
2.17. Анализ пролиферативной активности клеток ЦЖ, ЦЭ и ЦЭ-с
при культивировании на Лм
2.18. Микроскопия
2.19. Статистическая обработка результатов
3. РЕЗУЛЬТАТЫ
3.1. Пролиферативная активность клеток ЦЖ, ЦЭ, ЦЭ-с, аксиального органа (АО) и тидемановых телец (ТТ) in vivo.
3.1.1. Анализ ДНК-синтетической активности методом
включения аналога тимидина - бромодезоксиуридина (BrdU)
3.1.2. Митотическая активность клеток (окраска клеток АТ
к НЗ-фосфогистону)
3.2. Гистологический анализ суспензий клеток ЦЖ, ЦЭ и ЦЭ-с после окраски азур-эозином, определение доли малых клеток в
составе популяций
3.2.1. Гистологический анализ популяции клеток ЦЖ.
Динамика клеточного состава в ответ на травмирование
3.2.2. Гистологической анализ суспензий клеток ЦЭ.
Динамика клеточного состава в ответ на травмирование

3.2.3. Анализ популяции клеток ЦЭ-с
3.3. Окраска суспензий клеток ЦЭ и ЦЭ-с мембранным красителем DIL,
3.4. Идентификация некоторых типов клеток ЦЭ
3.4.1. Жгутиковые клетки ЦЭ,
3.4.2. Безъядерные элементы в составе ЦЭ
3.5. Анализ белкового состава суспензий клеток ЦЖ. ЦЭ и ЦЭ-с
3.6. Оценка возможности миграции малых эпителиоцитов из
«условно-интактного» эпителия
3.7. Окраска суспензий клеток АТ к транскрипционному фактору
Oct-4, маркеру стволовых клеток
3.8. Анализ суспензий клеток ЦЖ, ЦЭ и ЦЭ-с методом проточной цитофлуориметрии
3.9. Определение локализации малых клеток в составе ЦЭ
3.10. Культивирование клеток ЦЖ, ЦЭ и ЦЭ-с
3.10.1. Поведение клеток ЦЖ при культивировании
3.10.2. Поведение клеток ЦЭ при культивировании
3.10.3. Анализ включения BrdU in vitro
3.11. Морфофункциональный анализ клеток ЦЖ, ЦЭ и ЦЭ-с, способных прикрепляться к различным подложкам, с целью
выбора субстрата для культивирования
3.11.1. Особенности распластывания клеток ЦЖ на Фн,
ламинине, Пл и стекле
3.11.2. Особенности распластывания клеток ЦЭ и ЦЭ-с на
Фн, ламинине, Пл и стекле
3.11.3. Качественный состав популяций ЦЦ после прикрепления к Фн, ламинину, Пл или стеклу и динамика состава
в ответ на травмирование,
3.11.4. Качественный состав популяций ЦЭ после прикрепления к Фн, ламинину, Пл или стеклу и динамика состава
в ответ на травмирование,
половые клетки, которые прослеживаются в ходе развития организма благодаря наличию герминальных гранул в цитоплазме, что подтверждает их тотипотентность (обзоры Extavour, 2007; Cinalli et al., 2008; Исаева и др., 2009; Isaeva, 2011; Shukalyuk, Isaeva, 2012, in press).
Стволовые клетки взрослого организма делят на плюрипотентные, способные дифференцироваться во все типы клеток, однако не дающие целый организм, мультипотентные (прогениторные), способные дифференцироваться в ограниченное число клеточных типов и унипотентные клетки, которые являются предшественниками одного типа клеток (Marshak et al., 2001; Rinkevich, Matranga, 2009; Hui et al., 2011; Isaeva, 2011).
По-видимому, стволовые клетки морских беспозвоночных обладают самым высоким потенциалом «стволовости». Исследования стволовых клеток губок показали, что археоциты являются тотипотентными или плюрипотентными клетками (Muller, 2006; Funayama et al., 2010), стволовые клетки планарий (необласты) проявляют такие же свойства (Gschwentner et al., 2001; Shibata et al
2010). Свойствами тотипотентности обладают и стволовые клетки корнеголовых раков (Исаева и др., 2009; Isaeva, 2011). Интерстициальные клетки книдарий являются мультипотентными (показано для рода Hydra) или тотипотентными (Ну dr actinia echinata) (Kiinzel et al., 2010).
Для иглокожих на данном этапе таких данных немного - лишь амебоциты и целомоциты морской лилии можно назвать плюрипотентными стволовыми клетками (Candia-Camevali, 2006; Rinkevich, Matranga, 2009).
Особенностью большинства морских беспозвоночных является непрямое развитие, то есть развитие с метаморфозом. Стволовые клетки этих животных называют «резервными» (Isaeva, 2011). Теория резервных клеток была разработана Дэвидсоном с соавторами (Davidson, et al., 1995). При метаморфозе все клетки личинки погибают, остаются лишь те клетки, которые были «отложены» для развития взрослого организма. Эти клетки в конце личиночной жизни интенсивно