Роль конститутивного рецептора андростанов в реализации канцерогенного действия химических соединений в печени мышей

• Автор: Сметанина, Мария Александровна
• Шифр специальности: 03.02.07
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2012
• Место защиты: Новосибирск
• Количество страниц: 147 с. : ил.

ОГЛАВЛЕНИЕ:
СПИСОК ИСПОЛЬЗУЕМЫХ СОКРАЩЕНИЙ
ВВЕДЕНИЕ
1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ
1.1. Краткая характеристика основных этапов химического канцерогенеза
1.2. Метаболизм ксенобиотиков в печени
1.3. Рецепторы ксенобиотиков

1.4. Конститутивный рецептор андростанов
1.4.1. Строение рецептора
1.4.2. Структура и экспрессия гена CAR
1.4.3. Механизмы активации CAR
1.4.4. CAR-респонсивные элементы
1.4.5. Активаторы и репрессоры - модуляторы активности CAR
1.4.6. Роль CAR как ксеносенсора - посредника в ответе на ксенобиотический стресс
1.4.7. Роль CAR в физиологических и патологических
процессах
1.4.8. CAR-нокаутные мыши
2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
Материалы
Объекты исследования
2.1. Обработка животных
2.2. Трансфекция клеток и измерение активности люциферазы и |3-галактозидазы
2.3. ПЦР в реальном времени
2.3.1. Выделение РНК из клеток печени
2.3.2. Синтез к ДНК методом обратной транскрипции
2.3.3. Количественная ПЦР в режиме реального времени (ЮГС)-
РСЯ)
2.4. Генотипирование
2.4.1. Выделение геномной ДНК
2.4.2. Получение фрагментов ДНК с использованием ПЦР
2.4.3. Электрофорез фрагментов ДНК в агарозном геле
2.5. Получение экстрактов ядер клеток печени
2.6. Задержка ДНК-зонда в геле
2.6.1. Введение радиоактивной метки в ДНК с помощью фрагмента Клёнова
2.6.2. Задержка ДНК-зонда в геле белками экстрактов ядер
2.7. Вестерн-блот анализ
2.8. Иммуногистохимический анализ

2.8.1. Приготовление срезов печени
2.8.2. Иммуногистохимическое окрашивание срезов печени
2.9. Статистический анализ
3. РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ
3.1. Активация CAR и повышение экспрессии его генов-мишеней под действием гепатоканцерогена ОАТ
3.1.1. Влияние ОАТ на трансактивационную активность mCAR
in vitro
3.1.2. Влияние ОАТ на трансактивационную активность mPXR
in vitro
3.1.3. Влияние ОАТ на уровень мРНК генов-мишеней CAR в
печени мышей
3.1.4. Влияние ОАТ на уровень белков Сур2Ь10 и с-Мус в
печени мышей
3.1.5. Влияние ОАТ на пролиферацию гепатоцитов у мышей
дикого типа в сравнении с CAR-нокаутными мышами
3.2. Увеличение ДНК-связывающей активности CAR и повышение экспрессии его генов-мишеней под действием фенобарбитала связаны с риском развития опухолей у мышей
3.2.1. Изучение влияния фенобарбитала на ДНК-связывающую активность CAR в печени мышей СЗН, C57BL и CC57BR
3.2.2. Влияние фенобарбитала на уровень белка CAR в ядрах
клеток печени мышей СЗН, C57BL и CC57BR
3.2.3. Влияние фенобарбитала на уровень мРНК генов-мишеней
CAR в печени мышей СЗН, C57BL и CC57BR

RXR-LBD CAR-LBD

AGT/GTCA AGT/GTCA

Рисунок 4. Схема связывания комплекса CAR-RXR с REs (по Toison, Wang, 2010). Гетеродимер CAR-RXR способен связываться с REs, представленными DR3, DR4, DR5, IRO, ER6 и ER8 полусайта AGT/GTCA.
При связывании, аминокислотные остатки первого цинкового пальца ДНК-связывающего домена CAR непосредственно узнают полусайт. Второй цинковый палец неспецифично взаимодействует с сахарофосфатным остовом ДНК и служит одной из поверхностей димеризации рецептора (Giguere, 1999). В случае гетеродимеров установлено, что RXR занимает 5'-полусайт элемента, a CAR - З'-полусайт (Frank et al., 2003).
CAR-REs в литературе также могут называться “фенобарбитал-чувствительные элементы” (PBREs), “гормон-чувствительные элементы” (HREs) и “ксенобиотик-чувствительные элементы” (XREs). В генах-мишенях CAR может содержаться один или несколько REs, локализованных, как правило, в 5'-фланкирующей области, и реже - в последовательностях интронов, экзонов и 3'-фланкирующей области (Honkakoski et al, 1998; Sugatani et al., 2001; Frank et al., 2003).
1.4.5. Активаторы и репрессоры - модуляторы активности CAR
В отличие от классических ядерных рецепторов (рецепторов стероидных и тиреоидных гормонов), которые очень селективно связывают лиганды (значения равновесной константы диссоциации Kd порядка 1 нМ и