Метод десорбции ДНК для молекулярных и генетических исследований с помощью лазерного излучения терагерцового диапазона

• Автор: Горячковская, Татьяна Николаевна
• Шифр специальности: 03.02.07
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2011
• Место защиты: Новосибирск
• Количество страниц: 128 с. : ил.

ОГЛАВЛЕНИЕ
Введение
Глава 1 Обзор литературы
1.1 Использованием терагерцового излучения в молекулярно-биологических
исследованиях
1.1.1 Введение
1.1.2 Терагерцовая и инфракрасная спектроскопия
1.1.3 Использование терагерцового излучения в масс-спектрометрии
1.1.4 Десорбция и масс-спектрометрия ДНК
1.2 Методы измерения размеров наночастиц
1.2.1 Атомно-силовая микроскопия
1.2.2 Электронная микроскопия
1.2.3 Спектрометры аэрозолей
1.3 Характеристики Новосибирского Л СЭ
1.4 Механизмы абляции
1.5 Физические размеры ДНК
1.6 Заключение по обзору литературы
Глава 2 Приборная база, материалы и методы
2.1 Лазер на свободных электронах
2.2 Фурье-спектрометр «Bruker IFS 66v/S»
2.3 Диффузионный спектрометр аэрозолей
2.4 Атомно-силовая микроскопия
2.5 Электронная микроскопия
2.6 Подложки для препаратов
2.7 Наночастицы
2.8 Белки и ферменты
2.9 Препараты ДНК
2.10 Модельный биочип
2.11 Дизайн олигонуклеотидов для спектроскопии
2.12 Элюция ДНК с фильтра
2.13 Полимеразная цепная реакция
2.14 Секвенирование ДНК
2.15 Выделение фрагментов ДНК
2.16 Трансформация клеток E.coli плазмидной ДНК
2.17 Выделение плазмидной ДНК
Глава 3. Результаты
3.1 Десорбция ДНК больших размеров
3.1.1 Устройство станции
3.1.2 Подготовка проб
3.1.3 Подбор параметров излучения ЛСЭ
3.1.4 Измерение размеров наночастиц ДНК с помощью ДСА
3.1.5 «Аномальное» поведение биологических аэрозолей
3.2 Исследование молекулярно-генетических свойств ДНК после абляции
3.2.1 Анализ последовательности ДНК плазмиды pUC18 после абляции
3.2.2 Выделение и исследование последовательности целевой ДНК, связанной на
модельной ячейке биочипа
Глава 4. Обсуждение результатов
Заключение

Выводы
Публикации
Список литературы

Список сокращений
ДСА - диффузионный спектрометр аэрозолей,
ИК - инфракрасный,
ЛСЭ - лазер на свободных электронах,
ПЦР - полимеразная цепная реакция,
ТГц - терагерц,
т.п.н. - тысячи нуклеотидных пар,
Трис - 2-Амино-2-(гидроксиметил)-1,3-пропандиол,
УФ - ультрафиолетовый,
ЭДТА - этилендиаминтетра уксусная кислота, dNTP - дизоксинуклеотидтрифосфат,
ESI (electrospray ionization) - ионизация электрораспылением,
FEL (Free Electron Laser) - лазер на свободных электронах,
GPS (glycidoxypropyltrimethoxysilane) - глицидоксипропилтриметокси силан, НРА (hydroxypicolinic acid) - гидроксипиколиновая кислота,
LB (Luria-Bertani) - среда Лурия-Бертани
MALDI-MS (Matrix assisted Laser Desorption Ionisation Mass Spectrometry) -масс спектрометрия с лазерной десорбцией и ионизацией посредством матрицы
m/z - отношение массы частицы к заряду частицы,
SSC (saline-sodium citrate) - цитратный буфер,
SDS (sodium dodecyl sulfate) - додецил сульфат натрия,
Tween-20 - полисорбат 20, полиэтилен гликоль сорбит монолаурат.

В контактном методе острие зонда непосредственно соприкасается с поверхностью образца в процессе сканирования. В бесконтактном методе зонд находится достаточно далеко и не касается поверхности. Критическими для сканирования являются следующие параметры: радиус закругления конца иглы г и отношение высоты зонда к диаметру основания Аг = /УЖ (рисунок 13). Так, например, реальная толщина нити ДНК составляет около 2 нм, но при использовании для сканирования молекул ДНК стандартных зондов, с радиусом острия около 10 нм, получаются искаженные в большую сторону размеры.
Рисунок 13. Параметры геометрии зонда АСМ (А). Искажение изображения профиля поверхности вследствие конечной величины отношения аспекта и радиуса закругления острия (Б)
Для сканирования ДНК применяют специально модифицированные зонды, на конце которых наращены кристаллы углерода (рисунок 14).
Изготовление зондов для АСМ может осуществляться путем механической, химической или электрохимической обработки.

Изображение
Направление сканирования