Характеристика генов гороха (Pisum sativum L.), вовлечённых в формирование арбускулярной микоризы

• Автор: Кузнецова, Елена Владиславовна
• Шифр специальности: 03.02.07
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2010
• Место защиты: Санкт-Петербург
• Количество страниц: 191 с. : ил.

Содержание

Список сокращений

Введение

Г лава I. Обзор литературы

1.1. Арбускулярная микориза (AM)- один из наиболее распространённых симбиозов в природе

1.2. Формирование AM симбиоза

1.2.1. Стадии формирования AM

1.2.2. Цитологическая реорганизация растительной клетки

в процессе формирования AM

1.2.3. Микоризные мутанты растений

1.3. Молекулярные основы AM симбиоза

1.3.1. Ранние сигнальные взаимодействия
1.3.2. Гены растения, активируемые на ранних стадиях формирования AM симбиоза
1.3.3. AM специфичная экспрессия растительных и
грибных генов
1.3.4. Широкомасштабные исследования симбиоз-зависимых изменений транскриптома
растений и грибов
1.3.5. Влияние sym мутаций растений на активность генов симбиотических партнёров при образовании AM
1.3.6. Сходство AM симбиоза и симбиоза бобовых растений
с клубеньковыми бактериями {Rhizobium)
1.4. Генетическое картирование симбиотических генов бобовых растений для последующего позиционного клонирования генов
1.4.1. Клонирование симбиотических генов гороха
1.4.2. Использование молекулярных EST (expressed sequence tag-based) маркеров для генетического картирования
I.4.3. Использование синтении между геномами бобовых растений для картирования генов
Глава II. Материалы и-методы
II. 1. Биологический материал
П.2. Условия вегетации растений и отбор образцов для анализа
11.3. Определение параметров микоризации корней
11.4. Вырезание лазером кортикальных клеток, содержащих арбускулы (метод Laser Capture Microdissection)
II.4.1. Подготовка тканей к микродиссекции
II.4.2. Микродиссекция клеток, содержащих арбускулы
11.5. Гибридологический анализ

11.6. Выделение нуклеиновых кислот
11.6.1. Выделение РНК из корней растений
11.6.2. Выделение РНК из вырезанных лазером клеток, содержащих арбускулы
И.6.3. Выделение ДНК из листьев растений
II.6.4. Выделение плазмидной ДНК
11.7. Разделение нуклеиновых кислот электрофорезом в геле
П.7.1. Электрофорез ДНК в агарозном геле
11.7.2. Разделение РНК в денатурирующем агарозном геле
11.8. Полимеразная цепная реакция (ПЦР)
П.8.1.ПЦР
11.8.2. Конструирование праймеров
11.8.3. СинтеЗ'кДНК
11.8.4. Абсолютный количественный ПЦР «в реальном времени»
11.9. Секвенирование фрагментов ДНК
11.10. Клонирование продуктов ПЦР
П. 11. Разрезание ДНК фрагментов эндонуклеазами рестрикции
11.12. Разработка молекулярных маркеров для генетического картирования

II. 13. Статистическая обработка данных
Глава III. Результаты и обсуждение
III. 1. Влияние мутаций в генах PsSym36, PsSym33 и PsSym40 на
формирование арбускулярной микоризы
III. 1.1. Введение
III. 1.2. Результаты
III. 1.2.1. Развитие арбускулярной микоризы
III. 1.2.2. Рост растений
III. 1.3. Обсуждение 9
111.2. Экспрессия генов Glomus intraradices при формировании AM у мутантов гороха RisNod24 (Pssym36), SGEFix'-2 (Pssym33) и SGEFix'-l (Pssym40)
111.2.1. Введение
111.2.2. Результаты
111.2.2.1. Мутант RisNod24 (JPssym36)
111.2.2.2. Мутант SGEFix-2 (Pssym33)
111.2.2.3. Мутант SGEFix'-l (Pssym40)
111.2.3. Обсуждение
111.3. Дифференциальная экспрессия генов Pisum sativum L., предположительно связанных с формированием AM, в корнях мутантов гороха RisNod24 (Pssym36), SGEFix'-2 (Pssym33) и SGEFix'-l (Pssym40)
111.3.1. Введение
111.3.2. Результаты
111.3.2.1. Мутант RisNod24 (Pssym36)
111.3.2.2. Мутант SGEFix'-2 (Pssym33)
111.3.2.3. Мутант SGEFix'-l (Pssym40)
111.3.3. Обсуждение
111.4. Анализ транскрипции генов G. intraradices в клетках, содержащих арбускулы

Hexose
CH, GLYCOGEN
Г Гггп^ /
О СО* СИ/Х otyi».
itWuQu
Intraradical
GLYCOGEN
Extraradical
Рисунок 1.2. Биохимические пути метаболизма углерода, активируемые во внутреннем (intraradical) и внешнем (extraradical) мицелии AM гриба
(Bago et al., 2003)
Во внутреннем мицелии углерод, полученный от растения-хозяина, в форме гексозы конвертируется в карбогидраты и запасные липиды. Липиды и гликоген транспортируются из внутреннего во внешний мицелий. Во внешнем мицелии происходит синтез запасных (гликоген и трегалоза) и структурных (хитин) карбогидратов из гексозы, полученной из транспортированных из внутреннего мицелия карбогидратов и липидов.
Обозначения: intraradical - интрарадикальный (внутренний), extraradical -
экстрарадикальный (внешний), glycogen - гликоген, trehalose - трегалоза, chitin - хитин, triacylglycerol (TAG) - триацилглицерол, hexose - гексоза.
Б. Баго с коллегами (Вазо е1 а1., 2003) идентифицировали в АМ колонизированных корнях экспрессию грибных генов, кодирующих гликогенсинтазу (фермент ветвления гликогена), хитинсинтазу и глутамин-фруктоза-6-фосфат-аминотрансферазу (фермент синтеза хитина). Количественное определение экспрессии гена гликогенсинтазы (7. ШгагасИсез в микоризованных корнях, внешнем мицелии и прорастающих спорах