Актинобактерии рода Rhodococcus, трансформирующие амиды карбоновых кислот

• Автор: Павлова, Юлия Андреевна
• Шифр специальности: 03.02.03
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2012
• Место защиты: Пермь
• Количество страниц: 129 с. : ил.

ОГЛАВЛЕНИЕ

ВВЕДЕНИЕ
ГЛАВА 1 ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ
1.1 Организмы - продуценты амидаз
1.3. Ферментативная активность амидаз
1.4. Классификация и характеристика нитрилгидратаз и нитрилаз
1.5. Стереоселективность амидаз
1.6. Использование штаммов- продуцентов ферментов метаболизма нитрилов и амидов
ГЛАВА 2. ОБЪЕКТЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ
2.1. Объекты исследования
2.2. Среда и условия культивирования бактерий
2.3. Идентификация выделенных культур
2.4. Определение минимальных ингибирующих концентраций нитрилов и амидов
2.5. Трансформация нитрилов и амидов карбоновых кислот
2.6. Методы энзиматического анализа
2.7. Выделение ДНК и полимеразная цепная реакция
2.8 Праймеры и условия ПЦР-анализа
2.9. Секвенирование ДНК
2.10. Статистическая обработка
ГЛАВА 3. СЕЛЕКЦИЯ И ХАРАКТЕРИСТИКА КУЛЬТУРАЛЬНЫХ СВОЙСТВ ШТАММОВ, ПРОЯВЛЯЮЩИХ ВЫСОКУЮ ГИДРОЛИТИЧЕСКУЮ АКТИВНОСТЬ
3.1 Отбор и характеристика образцов почв для выделения микроорганизмов
3.2. Изучение аэробной гетеротрофной почвенной микрофлоры. Выделение и
селекция штаммов, метаболизирующих амиды и нитрилы
3.3 Селекция штаммов, проявляющих высокую гидролитическую активность

3.4. Идентификация почвенных изолятов, проявляющих высокую гидролитическую активность
3.5. Зависимость амидазной и нитрилгидратазной активности изолятов от фазы роста на среде с ацетонитрилом
3.6. Оценка минимальных ингибирующих концентраций нитрилов и амидов
3.7. Трансформация амидов и нитрилов выделенными штаммами
ГЛАВА 4. ХАРАКТЕРИСТИКА ФЕРМЕНТОВ МЕТАБОЛИЗМА АМИДОВ И НИТРИЛОВ ШТАММОВ RHODOCOCCUS
4.1. Влияние температуры на активность амидаз
4.2. Влияние pH на активность амидаз
4.3. Действие ряда ингибиторов на активность амидаз
4.4. Субстратная специфичность амидаз
4.5. Стабильность препарата амидазы после замораживания
4.6. Свойства ферментов метаболизма нитрилов
ГЛАВА 5. ПЦР-ДЕТЕКЦИЯ, СЕКВЕНИРОВАНИЕ И ФИЛОГЕНЕТИЧЕСКИЙ АНАЛИЗ ГЕНОВ МЕТАБОЛИЗМА АМИДОВ И НИТРИЛОВ
5.1. ПЦР-анализ генов амидаз
5.2. ПЦР-детекция генов нитрилгидратаз и нитрилаз
5.3. Анализ последовательности нуклеотидов, гомологичных генам амидаз
R. erythropolis, Gen Bank, М88614
5.4. Анализ последовательности нуклеотидов генов энантиоселективных амидаз, гомологичных ферментам из Rhodococcus sp. N-774, R. erythropolis AY026386, El2517 GenBank
5.5. Сравнение аминокислотных последовательностей амидаз
ЗАКЛЮЧЕНИЕ
ВЫВОДЫ
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

ВВЕДЕНИЕ
Актуальность проблемы
Амид азы (КФ 3.5.1.4) - ферменты, катализирующие гидролиз амидов с образованием соответствующих карбоновых кислот и аммония. Амидазы участвуют в метаболизме азота в клетках и широко распространены в природе, обнаружены у про- и эукариот. У бактерий появление амидазной активности часто связано с метаболизмом нитрилов. Амидазы, выделенные из различных источников, характеризуются различной субстратной специфичностью. Некоторые из них катализируют гидролиз амидов алифатических кислот, другие расщепляют ароматические амидосоединения, третьи гидролизуют амиды аминокислот. Некоторые амидазы обладают стереоселективностью. Однако наличие у бактерий ферментов разных видов и их способность трансформировать различные типы субстратов не являются родо- или видоспецифичными признаками [15]. Амидазную активность часто обнаруживают у протеобактерий, а также у актинобактерий (Noca.rd.ia, Rhodococcus, Arthrobacter).
Актуальность изучения амидаз и их продуцентов обусловлена значительной разнородностью структуры этих ферментов, свойств, генетической организации и регуляции активности, интеграции с другими процессами метаболизма, а также широкой субстратной специфичностью данных ферментов и стереоселективностью некоторых из них [4, 33, 43, 55]. Культуры, активно использующие амиды в качестве ростовых субстратов, обнаружены среди бактерий различных таксономических групп: Bacillus, Pseudomonas, Agrobacterium, Rhodococcus, Brevibacterium, Arthrobacter и др. [9, 10, 43, 55].
К настоящему времени амидазы остаются недостаточно изученными на молекулярном уровне, и их классификация окончательно не сформулирована. В классификации, основанной на субстратной

Установлено, что эти ферменты обладают значительной вариативностью каталитических свойств (субстратной специфичности, стабильности, термо- и pH-зависимости и т.д.), связанной с их структурным разнообразием. Показано, что некоторые грамотрицательные аэробные бактерии продуцируют нитрилазы с различной специфичностью. Ферменты штаммов Acidovorax facilis 72 W [37], Comamonas testosteroni [96] и Pseudomonas sp. SI [47, 48] также относятся к алифатическим нитрилазам.
Нитрилаза Acinetobacter sp. АК226 отличается широкой субстратной специфичностью, высокоактивна по отношению к акрилонитрилу и бензонитрилу, а также способна конвертировать 2-арилпропионитрилы в соответствующие кислоты и рацемический 2-(4'- изобутилфенил)-пропионитрил в S-(+)-2-(4'-изобутил фенил) пропионовую кислоту (S-(+)-ибупрофен) [164]. Стереоселективность также свойствена нитрилазе штамма Rhodococcus sp. NCIMB 11216 [58, 59]. Известен также региоселективный гидролиз ароматических динитрилов [45]
С использованием гербицида бромксинила в качестве источника азота был выделен продуцент нитрилазы К. pneumoniae ssp. ozaenae [107]. Обнаружено, что очищенный фермент этого штамма обладает более узкой субстратной специфичностью, чем другие нитрилазы. In vitro данный фермент не гидролизовал бензонитрил, очень медленно конвертировал 4-гидроксибензонитрил, но проявлял высокую активность по отношению к 3-5 '-дигалогенированным соединениям 4-гидроксибензонитрила:
бромксинилу, хлорксинилу и иоксинилу. Нитрилаза Nocardia sp. NCIMB 11215 также проявляет сродство к иоксинилу и бромксинилу, однако ее активность по отношению к последнему составляет менее 0,5% относительно скорости гидролиза бензонитрила [61].
В бактериях Alcaligenes faecalis АТСС8750 и JM3 обнаружены арилацетонитрилазы, имеющие различия в специфичности. Штамм
A. faecalis JM3 проявляет более высокую активность по отношению к акрилонитрилу, m-хлорбензилцианиду и 2-тиофенацетонитрилу, в то время,