Изучение молекулярно-биологических свойств вариантов вакцинного штамма Francisella tularensis с делетированными генами системы рекомбинации recA и recD

• Автор: Лапин, Александр Александрович
• Шифр специальности: 03.02.03, 03.01.03
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2011
• Место защиты: Оболенск
• Количество страниц: 129 с. : ил.

СОДЕРЖАНИЕ

ПЕРЕЧЕНЬ СОКРА1ЦЕНИЙ, УСЛОВНЫХ ОБОЗНАЧЕНИЙ, СИМВОЛОВ,

ЕДИНИЦ И ТЕРМИНОВ ВВЕДЕНИЕ

ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1.1. Характеристика возбудителя туляремии

1.1.1. Лабораторная диагностика

1.1.2. Вакцинный туляремийный штамм

1.2. Система рекомбинации микрорганизмов

1.2.1. Модель процесса гомологичной рекомбинации

1.2.2. КесА белок ключевой фермент гомологичной рекомбинации

1.2.3. ЛесА белок фермент, участвующий в процессах репарации

1.2.4. Фермент ЛесВСИ экзоиуклеаза V
1.2.5. Организация генома К магетшУ
1.2.6. Методы генетического исследования Р. Ш1агегт
1.2.7. Генетическая модификация генов рекомбинации вакцинных штаммов путь к их стабилизации.
1.2.8. Заключение по обзору литературы ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ
ГЛАВА 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
2.1. Штаммы микрорганизмов и клеточные линии
2.2. Плазмиды и праймеры
2.3. Среды и условия культивирования
2.4. Экспериментальные животные
2.5.Молскулярнобиологические методы
2.6. Методы биохимических исследований
2.7. Методы выделения и очистки рекомбинантного белка Л.есА
2.8. Индукция белка ЯесА под действием ультрафиолетового облучения у штамма Р. иагешя
2.9. Индукция белка ЯесА под действием налидиксовой кислоты у штамма Р. Ш1агетч
2 Методы иммунологических исследований
. Иммуноферментный анализ
. Получение мышиной антисыворотки к рекомбинантному белку ЛесА
2 Методы исследования биологических свойств штаммов ч нагешз с делениями генов гесА и гесО


Оценка динамики роста штаммов . i i vi
. Размножение штаммов . i в макрофагах
. Оценка выживаемости штаммов . i после лиофильного высушивания
. Оценка способности к гомологичной рекомбинации штаммов. i
Оценка устойчивости к ультрафиолетовому облучению штаммов . i
. Оценка воздействия перекиси водорода, на штаммы . i
. Определение устойчивости штаммов . i к нормальной кроличьей сыворотке
. Определение остаточной вирулентности штаммов . i
. Оценка протективности штаммов . i на мышиной модели
2. Методы статистической обработки результатов
РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ
ГЛАВА 3. БИОИНФОРМАЦИОННЫЙ АНАЛИЗ
АМИНОКИСЛОТНЫХ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙ КЛЮЧЕВЫХ БЕЛКОВ СИСТЕМЫ РЕКОМБИНАЦИИ И МУЛЬТИФЕРМЕНТНОГ О КОМПЛЕКСА ЭКЗОНУКЛЕАЗЫ V ШТАММОВ . I
3.1. Структурная организация гена гесА в геноме . i
3.2. Структурная организация гена в геноме . i
ГЛАВА 4. ПОЛУЧЕНИЕ ВАРИАНТА ВАКЦИННОГО ШТАММА . I С ДЕЛЕТИРОВАННЫМ ГЕНОМ
4.1. Создание плазмиды V гесА для переноса модифицированного гена гесА в хромосому . i
4.2. Перенос модифицированного гена гесА в хромосому . i
4.3. Аллельный обмен модифицированного гена гесА на нативную копию гена в хромосоме . i
4.4. Обсуждение
ГЛАВА 5. АНАЛИЗ ЭКСПРЕССИИ ГЕНА И СИНТЕЗА БЕЛКА КЛЕТКАМИ . I
5.1. Создание продуцента рекомбинантного белка i на основе штамма . i
ГЛАВА 6.
ГЛАВА 7.
5.2. Выделение, очистка и характеристика рекомбинантного белка i6 экспрессируемого клетками . i
5.3. Получение специфической сыворотки к рекомбинантному белку i6 и его характеристика
5.4. Оценка индукции белка у . i после воздействия ультрафиолетового облучения и налидиксовой кислоты
5.5. Оценка транскрипционной активности гена гесА . i
5.6. Обсуждение
ПОЛУЧЕНИЕ ШТАММА . I С
ДЕЛЕГИРОВАННЫМ ГЕНОМ
6.1. Создание плазмиды V для переноса
модифицированного гена в хромосому . i
6.2. Перенос модифицированного гена в хромосому . i
6.3. Аллельный обмен модифицированного гена на нативную копию гена в хромосоме . i
6.4. Комплементация вариантов вакцинного штамма . i с делениями генов гесА и
6.5. Обсуждение
ИЗУЧЕНИЕ ВЛИЯНИЯ ГЕНОВ СИСТЕМЫ
РЕКОМБИНАЦИИ И . I НА БИОЛОГИЧЕСКИЕ И ИММУНОЛОГИЧЕСКИЕ
СВОЙСТВА
7.1. Оценка способности к гомологичной рекомбинации штаммов . i с делециями генов гесА и
7.2. Оценка динамики роста штаммов . i с делециями генов гесА и i vi
7.3. Оценка выживаемости штаммов . i с
делециями генов гесА и после лиофильного
высушивания
7.4. Оценка частоты возникновения стрептомицин резистентных мутантов штаммов . i с делециями генов гесА и
7.5. Оценка устойчивости к ультрафиолетовому облучению штамма . i АеЫ
7.6. Оценка воздействия перекиси водорода на штаммы . i с делециями генов гесА и
7.7. Размножение штаммов . i с делециями генов гесА и в макрофагах
7.8. Определение устойчивости штаммов . i
с делециями генов гесА и к бактерицидному
действию нормальной 1фоличьей сыворотки
7.9. Определение остаточной вирулентности штаммов 0 . i с делециями генов гесА и
7 Оценка протективности штаммов . i с 1 делециями генов гесА И на мышиной модели экспериментальной туляремии
7 Обсуждение 2 ГЛАВА 8. СОЗДАНИЕ ПРАЙМЕРА СШ 1 ДЛЯ
ДИФФЕРЕНЦИАЦИИ ПОДВИДОВ
ТУЛЯРЕМИЙНОГО МИКРОБА И СИСТЕМЫ ПРАЙМЕРОВ И. ЗОНДОВ ДЛЯ ПЦР В РЕАЛЬНОМ ВРЕМЕНИ НА ОСНОВЕ ИДЕНТИФИКАЦИИ ГЕНА СИСТЕМЫ РЕКОМБИНАЦИИ РОДА I ДЛЯ ИНДИКАЦИИ ПОДВИДОВ . I
8.1. Создание системы из одного праймера для
дифференциации подвидов туляремийного микроба на
основе специфических регионов хромосомы . i, фланкированных iпоследовательностями подобными . i
8.2. Результаты испытаний ПЦР с использованием 4 одного.праймера i для дифференциации подвидов туляремийного микроба
8.3. Создание системы праймеров и зондов для ПЦР в 7 реальном времени для индикации и идентификации
подвидов . i на основе последовательности
гена
8.4. Результаты испытаний Г1ЦР в реальном времени для
I индикации подвидов . i на основе
последовательности гена
8.5. Обсуждение
ЗАКЛЮЧЕНИЕ
ВЫВОДЫ
СПИСОК ИСПОЛЬЗОВАННЫХ ИСТОЧНИКОВ


Аллельный обмен модифицированного гена на нативную копию гена в хромосоме . Комплементация вариантов вакцинного штамма . РЕКОМБИНАЦИИ И . Оценка способности к гомологичной рекомбинации штаммов . Оценка динамики роста штаммов . Оценка выживаемости штаммов . Оценка частоты возникновения стрептомицин резистентных мутантов штаммов . Оценка устойчивости к ультрафиолетовому облучению штамма . Оценка воздействия перекиси водорода на штаммы . Размножение штаммов . А и в макрофагах
7. Определение устойчивости штаммов . Определение остаточной вирулентности штаммов 0 . Оценка протективности штаммов . Обсуждение 2 ГЛАВА 8. ТУЛЯРЕМИЙНОГО МИКРОБА И СИСТЕМЫ ПРАЙМЕРОВ И. ЗОНДОВ ДЛЯ ПЦР В РЕАЛЬНОМ ВРЕМЕНИ НА ОСНОВЕ ИДЕНТИФИКАЦИИ ГЕНА СИСТЕМЫ РЕКОМБИНАЦИИ РОДА I ДЛЯ ИНДИКАЦИИ ПОДВИДОВ . Результаты испытаний ПЦР с использованием 4 одного. I индикации подвидов . ЪСЦЦт ТАЕ ОМ ЕМ Рш Ршк Сгп Сшк СпГ5 Ар Ар
. Туляремия зоонозная инфекция, имеющая природную очаговость. Особенностью данной инфекции, является множество путей передачи и высокая восприимчивость к заражению у людей По данным ФГУЗ ФЦГиЭ Роспотребнадзора на территории Российской Федерации природные очаги туляремии распространенны повсеместно,, поэтому наблюдаемый в настоящее время уровень заболеваемости в году зарегистрировано 5 случаев туляремии, по сравнению с годом случаев представляет несомненную проблему для Российского здравоохранения. Возбудителем туляремии является микроорганизм Р. В современной классификации выделяют четыре подвида Г. Ш1агепз1 зиЬзЛиШгепзи, яиЬзр. Ьяр. Иаазшйса и зиЪзр. Ша. Наиболее тяжелую форму заболевания вызывает подвид иагедш, циркулирующий на территории Северной Америки . Р. Шкиетз и другие виды бактерий рода РгапЫзеИа представляют немалый интерес для исследователей не только с точки зрения их дифференциации, но и изучения их генетической изменчивости. В связи с этим актуальной является проблема изучения, эволюционных механизмов генетической изменчивости данного микроорганизма. Для профилактики туляремии в Российской Федерации используется живая вакцина, основным недостатком которой является некоторая реактогенность и нестабильность . Поэтому в настоящее время актуальной является проблема создания нового поколения стабильных и менее реактогенных вакцинных туляремийных штаммов. Одним из путей решения данной проблемы, является стабилизация генома вакцинного туляремийного штамма инактивирован ием одного из механизмов генетической изменчивости. Наиболее значимым видом генетической
изменчивости является гомологичная рекомбинация. В последнее время данный процесс изучается у вакцинных штаммов некоторых микроорганизмов. Так, туберкулезная вакцина на основе штамма. В разных странах живую туберкулезную вакцину готовят на основе вариантов штаммаВ , i, , i . Среди этих вариантов только у штамма i, имеющего дефект в гене гесА, произошла стабилизация генома и не изменились протективные свойства . Инактивация генов гесЛ и гесВС в клетках ii привела к снижению вирулентности для мышей и замедленному росту в макрофагах менее выраженному в случае гесЛ мутантов Дефект в гене у . Таким образом, на примере штаммов М и . При сравнительноманализе нуклеотидной последовательности геномов видов ш разных подвидов ii были обнаружены гесА и. Ранее было показано наличие функциональноактивного гесЛподобного гена в геномах . Учитывая вышеизложенные факты, изучение роли гесА и подобных генов . ЦЕЛЬ ИССЛЕДОВАНИЯ изучение влияния генов системы
гомологичной рекомбинации гесА и на биологические и
иммунологические свойства вакцинного штамма . Биоинформационный анализ генов системы гомологичной рекомбинации гесА и у . Получение вакцинного варианта штамма . Получение продуцента . Получение антител к рекомбинантному белку . Получение вакцинного варианта штамма . Изучение влияния генов гесА и на свойства вакцинного штамма . Выбор последовательностей нуклеотидов в гене для ПЦР
диагностики с гибридизационнофлуоресцентной детекцией подвидов . НАУЧНАЯ НОВИЗНА. А и . Показано, что при инактивации гена гесА в геноме штамма . Установлено, что инактивация гена в геноме штамма .