Изучение внутриклеточного транспорта хитозана с помощью фотоактивируемого красителя на основе родамина

• Автор: Генералов, Александр Андреевич
• Шифр специальности: 03.01.06, 03.01.04
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2015
• Место защиты: Москва
• Количество страниц: 143 с. : ил.

СОДЕРЖАНИЕ
ВВЕДЕНИЕ

1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1Л Хитозан, структура, получение и применение хитозана в биомедицинских и

ветеринарных исследованиях

1Л Л Структура хитозана

1 Л.2 Физико-химические свойства хитозана

1Л .3 Применение хитозана в медицине и ветеринарии

1Л .4 Модификация хитозана

1 Л.5 Наночастицы на основе хитозана

1.2 Механизм взаимодействия хитозана с клетками
1.2Л Роль заряда хитозана и наночастиц на его основе
1.2.2 pH органелл клетки
1.2.3 Внутриклеточный транспорт хитозана
1.3 Явление флуоресценции и его применение в биологии
2. СОБСТВЕННЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ
2.1 МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
2.1.1 Материалы
2.1.2 Лабораторное оборудование
2.1.3 Синтез и характеристика производных хитозана
2.1.4 Физико-химические методы исследования
2.1.5 Исследование биологической активности хитозанов in vitro
2.2 РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ
2.2.1 Изучение спектральных параметров фотоактивируемого флуорофора ТМР-NN-
2.2.2 Изучение внутриклеточного транспорта флуорофора TMP-NN-
2.3 Получение и характеристика панели производных хитозана с различными физико-химическими свойствами, несущих флуоресцентную метку
2.4 Анализ внутриклеточного транспорта производных хитозана
3. ОБСУЖДЕНИЕ ПОЛУЧЕННЫХ РЕЗУЛЬТАТОВ

4. ВЫВОДЫ
5. ПРАКТИЧЕСКОЕ ИСПОЛЬЗОВАНИЕ ПОЛУЧЕННЫХ РЕЗУЛЬТАТОВ
6. РЕКОМЕНДАЦИИ ПО ИСПОЛЬЗОВАНИЮ НАУЧНЫХ ВЫВОДОВ
7. СПИСОК ИСПОЛЬЗОВАННОЙ ЛИТЕРАТУРЫ
ПРИЛОЖЕНИЯ

Список сокращений
АФК - активные формы кислорода (свободные радикалы)
ВЭЖХ - высокоэффективной жидкостной хроматографии
ДМСО - диметилсульфоксид
ДМФА - диметилформамид
ДНК - дезоксирибонуклеиновая кислота
ИК - инфракрасный
МТТ - метилтриазолтетразоль
НАД - никотинамидадениндинуклеотид
НАДФ - никотинамид аденин динуклеатид фосфат
НЧ - наночастицы
СДА - степенью дезацетилирования
ТМР - тетраметилродамин
ТЭМ - трансмиссионная электронная микроскопия
УФ - ультрафиолетовое излучение
ФИТЦ - флуоресцеин изотиоцианат
ФФК - фотоактивируемый флуоресцентный краситель
ХДА - хитиндезацетилаза
ЭДТА - этилендиаминтетрауксусная кислота
ЭПР - эндо плазматических ретикулум
GFP - зеленый флуоресцентный белок

до 90 нанометров [Nitin N., 2009]. Заряд НЧ играет важную роль при проникновении в ядро. В работе Nabeshi и др. показано, что не имеющие заряда силиконовые НЧ проникали в ядро, когда модифицированные амино- или наоборот карбоксильными группами - не достигали своей цели и оставались в цитоплазме [Nabeshi Н., 2011].
Также как и цитотоксичность, внутриклеточный транспорт НЧ зависит от их размера, формы, материала, заряда и гидрофобности. Нефагоцитирующие клетки поглощают округлые НЧ размером от 20 до 50 нанометров быстрее всего [Jiang W., 2008; Chithrani В., 2006; Gao H., 2005; Lu F., 2009; Wang S., 2010]. Другие данные показывают, что многие эпителиальные клетки хорошо поглощают частицы в диапазоне от 100 до 200 нанометров, что было показано в работе Win и др. [Win К., 2005]. Фагоцитирующие клетки, напротив, лучше поглощают частицы размером в 2-3 микрометра [Champion J., 2008]. В этом случае фагоцитоз идет медленнее чем, например, при поглощении частиц размером менее 300 нанометров [Raynal I., 2004].
Исследования влияния заряда (как положительного, так и отрицательного) и его плотности показали, что заряженные полистироловые и железооксидные НЧ проникают в клетку лучше, чем незаряженные аналоги [Jiang X., 2011; Thorek D., 2008; Villanueva A., 2009], причем лучше поглощаются положительно заряженные частицы [Brandenberger С., 2010; Chen L., 2011; Cho J., 2005]. Lunov и др. в свое работе изучали поглощение НЧ фагоцитарными клетками. Они сравнивали транспорт полистнроловых НЧ в различных типах фагоцитов. Исследования показали, что фагоциты лучше поглощают карбоксил-модифицированным НЧ, а моноциты - амино- модифицированные [Lunov О., 2011; Drutz D., 1978].
Под действием различных физиологических условий НЧ могут проходить в клетки как пассивным транспортом, так и активным (эндоцитоз). Механизм пассивного транспорта достаточно плохо изучен [Taylor U., 2010]. Основееым способом проникновения в клетку для НЧ считается эндоцитоз. Arviso и др. предположили, что при пассивном транспорте происходит нарушение мембранного потенциала положительным зарядом НЧ, за счет чего происходит