Рекомбинантные фрагменты альфа-фетопротеина человека для создания лекарств адресной доставки

• Автор: Шарапова, Ольга Андреевна
• Шифр специальности: 03.01.04
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2012
• Место защиты: Москва
• Количество страниц: 115 с. : ил.

Содержание
Список использованных сокращений
Введение
I. Обзор литературы
1. Проблема злокачественных новообразований и способы их лечения
Проблема злокачественных новообразований
Способы лечения раковых заболеваний
2. Лекарства адресного действия
Принцип адресной доставки лекарств
Использование антител в качестве молекул-носителей для адресной
доставки лекарств
Использование белков, связывающихся с раковыми клетками, в качестве молекул-носителей для адресной доставки лекарств
3. Альфа-фетопротеин человека - его строение и функциональные свойства
Введение
Строение алъфа-фетопротеина человека
Функциональные свойства алъфа-фетопротеина человека
4. Ренатурация рекомбинантных белков
Причины агрегации рекомбинантных белков при экспрессии в
бактериальной системе
Общие представления о ходе сворачивания белковой молекулы
Общие представления о процессе ренатурации белков
5. Основные методы ренатурации рекомбинантных белков
Ренатурация методом разбавления
Ренатурагщя методом пульс-разбавления
Ренатурация методом диализа
Основные параметры условий ренатурации
6. Ренатурация белков, иммобилизованных на твердом носителе
II. Материалы и методы
1. Препаративные методы
Получение нуклеотидной последовательности, кодирующей
полноразмерный АФП
Создание генно-инженерных конструкций для экспрессии вариантов С-
концевого домена А ФП
Продукция rAFP3D595 и rAFP3D609
Выделение и очистка ТВ, содержащих целевой белок, из клеток E. coli
2. Ренатурация rAFP3D595 и rAFP3D609
Ренатурация очищенного на Ni-смоле белка методом быстрого
разбавления
Ренатурация очищенного белка методом диализа
Ренатурация белка, иммобилизованного на кремниевой металло-хелатной смоле

3. Аналитические методы
Масс-спектрометрия
Анализ N-концевой последовательности аминокислот белка
Определение свободных сульфгидрилъных групп
Аналитическая хроматография
Круговой дихроизм (КД)
SDS-электрофорез в полиакриламидном геле
Определение концентрации белка
4. Исследование функциональных свойств rAFP3D595 и rAFP3D609
Конъюгирование rAFP3D595/rAFP3D609 с флуоресцентной метой
Клеточные линии
Анализ связывания и эндоцитоза rAFP3D595/rAFP3D609- опухолевых клетках и лимфоцитах
Микроскопия
Конъюгирование rAFP3D609 с ципрофлоксацином
Анализ цитотоксической активности конъюгата rAFP3D с цитостатиком в опухолевых клетках и лимфоцитах
III. Результаты и обсуждение
1. Клонирование и экспрессия вариантов С-концевого домена АФП
Экспрессия с помощью ИПТГ
Автоиндукция
2. Выделение и очистка ТВ
3. Ренатурация фрагментов С-концевого домена АФП
Ренатурация методом разбавления
Ренатурация методом диализа
Ренатурация фрагментов АФП на твердой фазе
Сравнение ренатурации методом разбавления и с помощью IMAC
4. Физико-химический анализ ренатурированных фрагментов АФП
Подтверждение идентичности полученного целевого белка методом масс-
спектром етрии
Анализ N-концевой последовательности фрагмента АФП
Хроматографический анализ олигомерного состояния белка
Определение числа сульфгидрилъных групп с помощью реактива Эллмана 88 Анализ вторичной структуры ренатурированных фрагментов методом КД
5. Анализ функционально свойств рекомбинантных фрагментов АФП
Распределение флуоресцентно меченных фрагментов АФП в
экспериментах in vitro
Химическое конъюгирование rAFP3D609 с ципрофлоксацином
Цитотоксическая активность конъюгата rAFP3D609-Cipro
Заключение
Выводы
Список литературы

Список использованных сокращений
АГ антиген
а.о. аминокислотные остатки
АТ антитело
АФП альфа-фетопротеин человека
БСА бычий сывороточный альбумин
жк жирная кислота
иптг изопропил-Р-Б-1 -тиогалактопиранозид
кд круговой дихроизм
кДНК кодирующая дезоксирибонуклеиновая кислота
МЛУ множественная лекарственная устойчивость
МоАТ моноклональные антитела
МоАТ- РАФП моноклональные антитела к рецептору альфа-фетопротеина человека
мРНК матричная рибонуклеиновая кислота
ОЕ оптические единицы
ПСА персульфат аммония
РАФП рецептор альфа-фетопротеина человека
РНК рибонуклеиновая кислота
ТВ тельца включения
ТЕМЕД 1М,1Ч,К ’ ,Ы ’ -тетраметилэтил ендиамин

чем к свободному цитостатику. Конъюгат АФП с доксорубицином подавлял рост клеток линии MCF-7, резистентных к данному цитостатику [138, 149-151]. Из этого можно заключить, что цитостатик в форме конъюгата с белковой молекулой-носителем способен обходить проблему множественной лекарственной устойчивости у раковых клеток.
В экспериментах in vivo были использованы мыши с меланомой В16. Предварительно в экспериментах in vitro было показано, что человеческий АФП проникает в клетки мышиной меланомы. Помимо этого известно, что человеческий АФП способен взаимодействовать с мышиными клетками, экспрессирующими рецептор к мышиному АФП. Конъюгаты АФП с доксорубицином при их внутривенном введении мышам с меланомой обеспечивали ингибирование роста опухоли более чем на 97% к моменту начала гибели контрольных животных, не получавших никакой терапии. Конъюгат более чем в два раза увеличивал среднюю продолжительность жизни исследуемых животных, в то время как свободный доксорубицин практически не оказывал на нее влияния [150].
В итоге, можно сказать, что цитостатики в форме конъюгатов с АФП проявляли значительно более высокую противоопухолевую активность в экспериментах in vitro и in vivo. Конъюгирование также позволило преодолеть множественную лекарственную устойчивость, часто возникающую у раковых клеток и значительно ограничивающую эффективность химиотерапии у людей. Это подтверждает перспективность использования АФП для адресной доставки лекарств к раковым клеткам.
Использование природного АФП для создания лекарственных препаратов ограничивается тем, что его единственным источником является абортивный материал. Во-первых, это связано с необходимостью тщательного контроля чистоты образца от вирусных и бактериальных инфекций. Во-вторых, во многих странах мира использование абортивного материала запрещено. Получение рекомбинантного белка в одобренных системах экспрессии позволит значи-