Влияние гомоцистеина на продукцию активных форм кислорода нейтрофилами крыс

• Автор: Брюшкова, Екатерина Александровна
• Шифр специальности: 03.01.04
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2012
• Место защиты: Москва
• Количество страниц: 120 с. : ил.

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ
1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ
1.1. Гомоцистеин
1.1.1. Метаболизм гомоцистеина
1.1.2. Причины повышения концентрации гомоцистеина в плазме крови
1.1.3. Гомоцистеин как фактор риска
1.2. Глутаматные рецепторы как возможная мишень для действия ГЦ
1.2.1. Общая характеристика глутаматных рецепторов
1.2.2. NMDA-рецептор: структура и функции
1.2.3. Нейролротекторный и экзайтотоксический пути активации NMDA-рецепторов
1.3. Влияние ГЦ на клетки крови. Нейтрофилы
1.3.1. Общая характеристика нейтрофилов
1.3.2. Функциональная активность нейтрофилов
1.3.3. Системы генерации АФК в нейтрофилах
1.3.3.1. NADPH-оксидаза - источник АФК в нейтрофилах
1.3.3.2. Миелопероксидаза
1.3.4. Рецепторы нейтрофилов
II. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ
II. 1. Выделение нейтрофилов
II. 1.1. Выделение нейтрофилов из периферической крови
II. 1.2. Выделение активированных in vivo нейтрофилов
11.2. Выделение суспензии нейронов из мозжечка крыс
11.3. Подсчет клеток в камере Горяева
11.4. Опсонизация зимозана
11.5. Хемилюминометрический метод регистрации активных форм кислорода
11.6. Определение активности коммерческого препарата миелопероксидазы человека
11.6.1. Измерение продукции гипохлорита в ходе реакции, катализируемой препаратом миелопероксидазы
11.6.2. Спектрофотометрический метод измерения акгивности миелопероксидазы
11.6.3. Исследование возможности прямого взаимодействия гомоцистеина с гипохлоритом
11.7. Исследование клеток методом проточной цитометрии
11.7.1. Принцип метода проточной цитометрии
11.7.2. Побор оптимальных условий выделения нейтрофилов из общей лейкомассы на среде MonoPoly
II.7.3. Получение очищенной суспензии интактных нейтрофилов
II.7.4. Иммунофлуоресцентное окрашивание клеток
11.8. Идентификация белковых субъединиц NMDA-рецептора
11.8.1. Лизис клеток и иммунопреципитация белка
11.8.2. Разделение белков методом электрофорез в SDS-полиакриламидном геле
11.8.3. Вестерн блоттинг
II.8.4. Идентификация белка методом усиленной хемилюминесценции (ECL)
II.9. ПЦР
11.9.1 Индукция экспрессии мРНК для NR1 субъединицы NMDA-рецептора
11.9.2 Выделение тотальной РНК
11.9.3. Получение кДНК в реакции обратной транскрипции
11.9.4. Проведение полимеразной цепной реакции в реальном времени (РТ-ПЦР)
11.10. Определение концентрации цАМФ в нейтрофилах
II. 10.1. Принцип метода
II. 10.2. Определение концентрации цАМФ в нейтрофилах
11.11. Статистическая обработка результатов
III. РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ
III. 1. Исследование действия гомоцистеина на генерацию активных форм кислорода интактными и активированными in vivo нейтрофилами
111.2. Исследование механизмов антиоксидантного эффекта ГЦ
III.2.1. Ферментативные системы нейтрофилов, отвечающие за генерацию АФК
III.2.2. Изучение влияния ГЦ на коммерческий препарат миелопероксидазы
III.2.2.1 Влияние ГЦ на активность МПО, измеренную хемилюминесцентным методом
111.2.2.2. Исследование прямого взаимодействия ГЦ с гипохлорит-анионом
111.2.2.3. Влияние ГЦ и других серосодержащих соединений на активность МПО, измеренную в присутствии о-дианизидина
111.3. Исследование возможности рецепторного воздействия ГЦ на нейтрофилы
111.3.1. Определение экспрессии мРНК к NR 1 субъединице NMDA-рецепторного комплекса
111.3.2. Идентификация субъединиц NMDA-рецептора в активированных in vivo нейтрофилах
111.3.3. Исследование экспрессии NR2B субъединицы NMDA-рецептора на поверхности интактных и активированных in vivo нейтрофилов
111.3.4 Исследование роли NMDA-рецепторов в ГЦ-индуцируемом усилении продукции АФК активированными in vivo нейтрофилами
111.3.5 Исследование возможного механизма реализации действия ГЦ активированные in vivo нейтрофилы через NMDА-рецепторы
111.4. Исследование других возможных путей реализации эффекта гомоцистеина
111.4.1. Изучение роли метаботропных глутаматных рецепторов в реализации действия ГЦ
111.4.2. Изучение роли аденозиновых рецепторов в реализации действия ГЦ
IV. ЗАКЛЮЧЕНИЕ
ВЫВОДЫ
БЛАГОДАРНОСТИ
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

Рис. 11. Окисление о-дпанизидина миелопероксидазой.
Измерения проводили в среде (конечный объем 900 мкл), содержащей 10 мМ калий-фосфатный буфер (pH 7,0), 50 мкМ Н2О2 и 0,33 мМ о-дианизидин. Реакцию начинали добавлением 0,05 ед. активности коммерческого препарата МПО. За ходом реакции следили по возрастанию оптической плотности при X = 460 нм, измерения проводили на спектрофотометре «НйасЫ 20-200» (Токио, Япония), результаты выражали в изменении оптической плотности в мин на мкг МПО.
Прямое взаимодействие гомоцистеина с гипохлоритом, основным продуктом мие-лопероксидазной реакции, оценивали по спектрам поглощения этих веществ и их смеси в ультрафиолетовой области от 300 до 220 нм (при концентрациях исследуемых соединений 0,42 мМ каждого). Появление продукта взаимодействия ГЦ с гипохлоритом - хлорамина гомоцистеина - определяли по появлению пика поглощения при 252 нм [Thomas et al, 1986]. В опытах использовали реактивы фирмы «Sigma-Aldrich» (США), измерения проводили на спектрофотометре «Hitachi 20-200» (Токио, Япония).
II.7. Исследование клеток методом проточной цитометрии
11.7.1. Принцип метода проточной цитометрии
Проточная цитометрия позволяет анализировать 1000 клеток в секунду по нескольким параметрам одновременно. В основе метода проточной цитометрии лежит измерение для каждой отдельно взятой клетки таких параметров как размер, внутренняя структура (гранулярность) и интенсивность флуоресценции внутриклеточных зондов.
В измерительной ячейке проточного цитометра исследуемая суспензия клеток под давлением подается в капилляр и попадает в поток в поток жидкости, проходящий под высоким давлением через проточную ячейку прибора. В силу ее физико-химических свойств по краям потока создается более высокое давление, чем в центре. Стремясь,
11.6.3. Исследование возможности прямого взаимодействия гомоцистеина с гипохлоритом