Характеристика ckit позитивных резидентных стволовых клеток миокарда у больных ишемической болезнью сердца

• Автор: Дергилев, Константин Владимирович
• Шифр специальности: 03.01.04
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2011
• Место защиты: Москва
• Количество страниц: 164 с. : 32 ил.

ОГЛАВЛЕНИЕ
СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ
АКТУАЛЬНОСТЬ ПРОБЛЕМЫ
НАУЧНАЯ НОВИЗНА
ПРАКТИЧЕСКАЯ ЗНАЧИМОСТЬ
ВНЕДРЕНИЕ В ПРАКТИКУ 10'
ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ*
Регенеративный потенциал сердца
Применение СТВОЛОВЫХ клеток ДЛЯ лечения болезней сердечно-сосудистой системы
Клеточная терапия инфаркта миокарда
Клеточная терапия хронической ИБС и постинфарктной сердечной недостаточности
Резидентные стволовые клетки сердца
Islet-1 клетки
Sp-популяция
С—kit позитивные клетки
Клетки, образующие кардиосферы
Sca-1 клетки
Клеточная ниша
Активация стволовых клеток сердца
Перспективы применил стволовых клеток сердца для регенерации миокарда
Стволовые клетки сердца при патологии миокарда и старении
Стволовые клетки сердца при остром инфаркте миокарда и отдаленном постинфарктном периоде
Стволовые клетки сердца при диабетической кардиомиопатии
Старение миокарда и стволовые клетки сердца
Заключение
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
Характеристика пациентов, включенных в исследование
Методы обследования в клинике
Лабораторное обследование
Инструментальное обследование
Биохимические методы
Иммуноблоттинг
Иммуноферментный анализ
Выделение РНК
Реакция обратной транскрипции
Полимеразная цепная реакция в реальном времени
Электрофорез ампликонов
Цитологические и гистологические методы
Иммунофлуоресцентное окрашивание ткани миокарда

Получение первичной культуры клеток сердца
Иммунофлуоресцентное окрашивание выделенных клеток и ^
проточная цитофлуориметрия
Культивирование клеток методом эксплантной культуры и ^
получение кардиосфер
Сортировка клеток эксплантной культуры методом gj
иммуномагнитной селекции с использованием антител к с—kit. Клональный анализ c-kit+ клеток ушка правого предсердия 82"
Оценка пролиферации c-kit+ клеток ушка правого предсердия
Оценка способности c-kit+ клеток образовывать капилляроподобные g7 структуры in vitro
Иммунофлуоресцентное окрашивание клеток
Культивирование c-kit+клеток в условиях гипоксии
Исследование способности к дифференцировке стволовых клеток сердца
Дифференцировка с—кП+ клеток в кардиомиоцитарном и эндотелиальном направлениях
Дифференцировка с—кй+ клеток в адипогенном и остеогенном направлениях
Статистический анализ
РЕЗУЛЬТАТЫ 88.
Распределение с-кй+ клеток в миокарде и влияние возраста человека ^
на их количество
Анализ иммунофенотипа с-кй+ клеток миокарда
Сопоставление количества с-кй+ клеток в миокарде с клиническими ^
характеристиками больных ИБС
Отработка методики выделения и экспансии с—кй+ клеток миокарда в культуре
Анализ экспрессии генов плюрипотентности в клетках эксплантной ^
культуры
Получение и анализ кардиосфер
Получение с—кП+ клеток из эксплантной культуры с помощью ^ р
иммуномагнитной селекции
Клональный анализ с-кй+ клеток миокарда
Секреция ангиогенных факторов роста с-кй+ клетками миокарда
Дифференцировочный потенциал с-кй+ клеток миокарда человека
ОБСУЖДЕНИЕ
ЗАКЛЮЧЕНИЕ
КЛИНИЧЕСКИЕ ПРИМЕРЫ
ВЫВОДЫ
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ
1В-БВО 18-фтор дезоксиглюкоза
ЬБОБ основный фактор роста фибробластов*
ВМР морфогенетические белки костной ткани
с~кії рецептор к фактору стволовых клеток
С-теї рецептор к фактору роста гепатоцитов
СХСЯ4 рецептор к ББР-І (фактору, стромальных клеток)
ЕОБ эпидермальный фактор роста
О-СвБ гранулоцитарный колониестимулирующий фактор роста
ОБР зеленый флуоресцентный белок
Жй фактор роста гепатоцитов
НБР белки теплового шока
НЦУЕС эндотелиальные клетки пупочной вены человека
ЮР-1 инсулиноподобный фактор роста
ШР-ІЯ рецептор инсулиноподобного фактора роста
ЫеМ популяция недифференцированных прогениторных клеток
КОК/РІк-І рецептор к фактору роста эндотелия сосудов
ш лейкемический ингибиторный фактор
МОЮ белок множественной лекарственной устойчивости
1ЖР белок, ингибирующий эритропоэз
МУНА Нью-Йоркская кардиологическая ассоциация
Бса-І рецептор гематопоэтических и резидентных стволовых клеток мыши
БСБ фактор роста стволовых клеток
ББЕ-І фактор стромальных клеток
88ЕА1 антиген эмбриональных стволовых клеток
тор р трансформирующий фактор роста р
УЕОБ фактор роста эндотелия сосудов
vW фактор фон Виллибранда
АКШ аортокоронарное шунтирование
АПФ ангиотензинпревращающий фермент
АТ, рецептор к ангиотензину 1 типа
АТФ аденозинтрифосфат
АФК активные формы кислорода
ДА диагональная коронарная артерия
ДКМП дилатационная кардиомиопатия
днк дезоксирибонуклеиновая кислота
ЖЕЛ жизненная емкость легких
ИБС ишемическая болезнь сердца
ИМ инфаркт миокарда
ИФА иммуноферментный анализ
кдд конечно-диастолическое давление

популяции несут на своей поверхности маркеры стволовых клеток (с—kit и sca-1 (у мыши)) и способны дифференцироваться в кардиомиоциты в присутствии соответствующего микроокружения [178]. Напротив, sp-популяция клеток, выделяемая из скелетных мышц, печени и легких нес т маркер CD45 и способна образовывать гематопоэтические колонии, что скорее свидетельствует об их костномозговом происхождении [24].
При сравнении транскрипционного профиля sp-популяции клеток сердца взрослого организма с эмбриональными СКС, клетками sp-популяции костного мозга и дифференцированными кардиомиоцитами, оказалось, что клетки sp-популяции сердца реализуют сходную с эмбриональными стволовыми клетками сердца молекулярную программу, включая экспрессию генов, кодирующих Notch и TGF(3 сигнальные пути, а также генов, ответственных за детоксикацию и оксидативный стресс [187]. Кроме того, они экспрессируют транскрипционные факторы кардиомиоцитарной и эндотелиальной дифференцировки, однако не экспрессируют маркеры зрелых кардиомиоцитов. Дальнейший анализ с использованием генетических матриц показал, что sp-клетки сердца экспрессируют гены стволовых клеток (с—kit, sca-1 и MDR1).
При со-культивировании sp-клеток с кардиомиоцитами in vitro наблюдается индукция кардиомиогенеза: последовательно включается
экспрессия ранних маркеров кардиомиогенеза (транскрипционного фактора Mef 2с и белков семейства Gata), затем экспрессия белков сократительного аппарата и белков, характерных для зрелых кардиомиоцитов, таких как а-саркомерный актин, саркомерный а-актинин, тропонин I; происходит формирование щелевых контактов, содержащих коннексин-43, и участвующих в электромеханическом сопряжении сокращающихся кардиомиоцитов [230, 118, 187].
Установлено, что sp-клетки неонатальных сердец способны образовывать шарообразные кластеры клеток, подобные нейросферам, называемые кардиосферами [299], в центре которых находятся