Экспериментальные подходы к обнаружению опухолеспецифичных молекул в крови онкологических больных с использованием ДНК-аптамеров : на примере рака легкого человека

• Автор: Замай, Галина Сергеевна
• Шифр специальности: 03.01.04
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2014
• Место защиты: Красноярск
• Количество страниц: 137 с. : ил.

ОГЛАВЛЕНИЕ
Введение

1. Обзор литературы

1.1. Современные представления о канцерогенезе

1.2. Циркулирующие опухолевые клетки и микроэмболы

1.3. Рак легкого

1.3.1. Причины развития и основные методы диагностики рака легкого человека

1.3.2. Гистологические типы рака легкого человека

1.3.3. Белковые биомаркеры рака легкого человека

1.4. Аптамеры

1.4.1. Характеристика аптамеров
1.4.2. Селекция аптамеров
1.5. Применение аптамеров в онкологии
1.5.1. Потенциальные возможности терапии онкозаболеваний с помощью аптамеров
1.5.2. Выявление опухолей с помощью аптамеров
1.5.3. Применение аптамеров для диагностики рака легкого человека
2. Материалы и методы
2.1. Объект исследований
2.2 Селекция аптамеров к опухолевой ткани легкого человека
2.3 Контроль селекции аптамеров с помощью электрофореза
2.4. Оценка специфичности связывания пулов аптамеров с опухолевой тканью
легкого человека методом флуоресцентной микроскопии
2.5 Оценка специфичности связывания пулов аптамеров с опухолевыми клетками легкого человека методом проточной цитометрии
2.6. Клонирование аптамеров
2.7. Секвенирование и синтез аптамеров
2.8. Выбор аптамеров, наиболее аффинных к опухолевым клеткам легкого человека
2.9 Определение специфичности связывания аптамеров с нормальной тканью легкого человека
2.10 Определение специфичности связывания аптамеров с лимфоцитами
2.11 Оценка кажущейся константы диссоциации наиболее аффиного аптамера с клетками аденокарциномы легкого
2.12 Конфокальная микроскопия клеток аденокарциномы легкого, связавшихся с аптамерами и антителами к цитокератинам

2.13 Выявление молекулярных мишеней, специфичных для полученных аптамеров, в периферической крови методом проточной цитометрии
2.14 Выявление молекулярных мишеней, специфичных для полученных аптамеров, в периферической крови методами конфокальной и флуоресцентной микроскопии
2.15 Анализ гистологических срезов с помощью аптамеров
2.16 Выявление потенциальных биомаркеров аденокарциномы легкого человека
2.17 Статистический анализ результатов масс-спектрометрии
3. Результаты и обсуждения
3.1 Селекция аптамеров к опухолевой ткани легкого человека и контроль селекции аптамеров с помощью электрофореза
3.2 Оценка аффинности связывания пула аптамеров с опухолевой тканью легкого человека методом проточной цитометрии
3.3 Оценка специфичности связывания пулов аптамеров с опухолевыми клетками легкого человека
3.4 Клонирование аптамеров
3.5 Секвенирование и синтез аптамеров
3.6 Выбор аптамеров, обладающих наибольшей аффинностью к опухолевым клеткам легкого человека
3.7 Определение специфичности связывания аптамеров с нормальными клетками легкого человека
3.8 Определение специфичности связывания аптамеров с лимфоцитами
3.9 Оценка кажущейся константы диссоциации наиболее аффинного клона аптамеров
3.10 Конфокальная микроскопия клеток аденокарциномы легкого, связавшихся с аптамерами и антителами к цитокератинам
3.11 Выявление опухолевых элементов в крови больных раком легкого человека
3.12 Анализ гистологических срезов с помощью аптамеров
3.13 Выявление мишеней аптамеров - потенциальных биомаркеров рака легкого
4. Заключение
5. Выводы
6. Благодарности
7. Библиографический список

СПИСОК ПРИНЯТЫХ СОКРАЩЕНИЙ
РЛ - рак легкого
MPJ1 - мелкоклеточный рак легкого
HMPJI - немелкоклеточный рак легкого
ЦОК - циркулирующие опухолевые клетки
ДНК - дезоксирибонуклеиновая кислота
оцДНК - одноцепочечная дезоксирибонуклеиновая кислота
dNTP - дезокситрифосфаты
ПЦР - полимеразная цепная реакция
РНК - рибонуклеиновая кислота
Kd - константа диссоциации
PBS - фосфатный буфер
SELEX - Системная Эволюция Лигандов Экспоненциальным Обогащением

позволяет улучшить отделение связавшихся и не связавшихся нуклеиновых кислот, в результате чего для подбора высокоспецифичных аптамеров требуется всего несколько раундов селекции (Krylov S.N., 2003).
Метод разделения, основанный на капиллярном электрофорезе, значительно ускоряет селекцию за счет использования электрофоретической мобильности белково-аптамерных комплексов (Porschevski Р., 2006). Однако такой подход
ограничен использованием, в основном, белков, поскольку нейтральные молекулы не могут быть подвержены действию электрического поля. Кроме того, данная методика не применима по отношению к молекулам, имеющим молекулярный вес ниже молекулярного веса компонентов библиотеки олигонуклоетидов (Mairal Т., 2008).
Один из методов селекции с использованием капиллярного электрофореза разработал Berezovski et al. (Berezovski М., 2005). С помощью описанного метода селекции «NECEEM» (non-equilibrium capillmy electrophoresis of equilibrium mixtures) можно выбирать аптамеры за гораздо меньшее число раундов, а также определять параметры связывания. В первом раунде ДНК-библибтека смешивается с мишенью и инкубируется для создания равновесной смеси. Затем, смесь, содержащую не связавшиеся ДНК, комплексы ДНК с мишенью и просто мишени, разделяют с помощью капиллярного электрофореза, чтобы получить равновесные фракции ДНК с мишенью и просто ДНК. Поскольку все свободные ДНК обладают схожей электрофоретической мобильностью, они все мигрируют в одну зону. Затем фракции собираются. Для выбора более специфичных аптамеров можно сочетать позитивную и негативную селекцию.
Автоматическая селекция аптамеров
Обычно аптамеры подбирают в течение приблизительно 15 раундов селекции, что занимает от нескольких недель до месяцев. Для того чтобы выбирать аптамеры в более короткие сроки и с минимальными трудозатратами была разработана автоматическая роботизированная система. Автоматизация позволяет делать более 10 раундов селекции в день (Mairal Т., 2008).