Локализация факторов эксцизионной репарации нуклеотидов на повреждённой ДНК

• Автор: Красикова, Юлия Сергеевна
• Шифр специальности: 03.01.04
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2012
• Место защиты: Новосибирск
• Количество страниц: 134 с. : ил.

Оглавление
Принятые сокращения
Введение
Раздел 1. Литературный Обзор
1.2. Генетические заболевания, ассоциированные с нарушениями в работе системы ЭРН
1.3. Группы комплементации Xeroderma pigmentosum
1.4. Реконструкция реакции ЭРН in vitro
1.5. Особенности субстратов системы ЭРН
1.6. Механизм узнавания повреждения: от модели «двойного узнавания субстрата» к пошаговой дискриминации повреждения
1.7. Порядок сборки факторов в процессе ЭРН
1.7.1. Репарасомная модель
1.7.2. Модель кооперативного (случайного) связывания
1.7.3. Модель последовательного связывания
1.8. Узнавание повреждения факторами ЭРН
1.8.1. Комплекс XPC-HR23b
1.8.1.1. Модель последовательного связывания «ХРС первый»
1.8.1.2. Субъединицы комплекса XPC-HR23b-Cen2
1.8.1.3. Доменная организация структуры ХРС
1.8.1.4. Взаимодействие ХРС с ДНК
1.8.1.5. Локализация ХРС на повреждённой ДНК
1.8.2. Комплекс RPA-XPA
1.8.2.1. Модель последовательного связывания «первый комплекс RPA-XPA»
1.8.2.2. Роль RPA в ЭРН
1.8.2.3. ХРА - сенсор изгибов в структуре ДНК
1.8.2.4. Локализация факторов RPA и ХРА на повреждённой ДНК
1.8.3. UV-DDB необходимый помощник или основной участник?
1.8.3.1. Взаимодействие UV-DDB с ДНК
1.8.3.2. Роль UV-DDB в процессе убиквитинилирования
1.8.4. TFIIH — сенсор изменений природы нуклеотидов
1.8.4.1. Роль геликаз ХРВ и XPD в процессе ЭРН
1.8.4.2. Взаимодействие TFIIH с другими факторами ЭРН
1.8.4.3. Взаимодействие TFII1I с ДНК
Заключение
Раздел 2. Экспериментальная часть
2.1. Материалы
2.2. Методы исследования
2.2.1. Гелъ-электрофорез белков и нуклеиновых кислот в ПААГ
2.2.2. Введение [32Р]-метки по 5'-концу олигонуклеотида
2.2.3. Получение ДНК-дуплексов
2.2.4. Введение фотореакционноспособной группы в З'-конец праймера (удлинение ДПК-праймера, катализируемое Pol /3)
2.2.5. Изучение комтексообразования белков с ДНК методом задержки в геле
2.2.6. Определение доли активного белка в его препарате
2.2.7. Определение степени связывания (ПО) XPC-HR23b с ДНК методом флуоресцентного титрования

2.2.8. Изучение комплексообразования белков с ДНК методом флуоресцентного титрования и определение констант диссоциации комплекса XPC-HR23b с ДНК
2.2.9. Фотоаффинная модификация белков
2.2.10. Определение места специфического контакта белка с ДНК с помощью нуклеазного расщетения ДНК в присутствии исследуемых белков
2.2.11. Определение угла изгиба повреждённого ДНК-дуплекса
Раздел 3. Результаты и обсуяедение
3.1. Первичное узнавание поврежденного участка ДНК гетеродимером XPC-IIR23b
3.1.1. Исследование топографии комплекса XPC-HR23b с повреждённой ДНК методом фотоаффинной модификации. Сравнение результатов с данными РСА дрожжевого ортолога ХРС
3.1.2. Связывание XPC-HR23b с поврежденной ДНК
3.1.3. Количественные характеристики взаимодействия XPC-HR23b с различными типами ДНК-структур
3.1.4. Влияние ХРА на взаимодействие XPC-HR23b с повреждённой ДНК
3.1.5. Влияние RPA на взаимодействие XPC-HR23b с повреждённой ДНК
3.2. Белки ХРЛ и RPA - основные структурные элементы предрасгцепляющего комплекса
3.2.1. Взаимодействие ХРА с повреждённой ДНК
3.2.2. Локализация ХРА на ДНК-дутексе, содержащем объёмное повреждение в составе области неспаренных оснований
3.2.3. Связь структуры ХРА с его местом локализации па частично раскрытом ДНК-дут ексе
3. 2.4. Взаимодействие RPA с различными типами ДНК-структур
3.2.5. Влияние RPA на эффективность комплексообразования XPC-HR23b сДНК-дуплексом, содержащим повреждение в составе области неспаренных оснований
3.2.6. Локализация RPA на частично раскрытом ДНК-дуплексе
3.2.7. Взаимодействие RPA с ДНК-дуплексами, содержащими выступающие одноцепочечные участки
3.2.8. Взаимодействие ХРА и RPA при связывании с ДНК
Заключение
Выводы
Список литературы
Принятые сокращения
а. о. - аминокислотный остаток
БСА - бычий сывороточный альбумин
БШД1-3 - р-шпилечные домены
ДСД - ДНК-связываюгций домен
ДТТ - 1,4-димеркаптобутан-2,3-диол (дитиотриитол)
н. о. - нуклеотидный остаток
ОВ-домен - олигонуклеотид/олигосахарид связывающий домен ПААГ - полиакриламидный гель
Пигментная ксеродерма (Xeroderma pigmentosum, ХР) -заболевание кожи Предрасщепляюгций комплекс, ПРК - белок-нуклеиновый комплекс, формирующийся поврежденной ДНК на этапе ЭРН, предшествующем выщеплегшю поврежденного фрагмента ДНК
РСА - рентгеноструктурный анализ Т-Т-димер - тиминовый димер УФ-свет - ультрафиолетовый свет
Цисплатин - фармакологическое название препарата гис-платины (цис-дихлордиамминплатина (II))
ЭРН - эксцизионная репарация нуклеотидов ЭРО - эксцизионная репарация оснований
(6-4)-фотопродукт - тиминовый димер (пиримидин-(6-4)-пиримидон)
5I-dUMP - 5-йодо-2'-дезоксиуридин-5'-монофосфат AAF-dGMP - Кт-(гуани11-8-ил)-ацетиламинофлуореновый аддукт CS - синдром Коккейна
CSA - фактор синдрома Коккейна комплементационной группы А
CSB - фактор синдрома Коккейна комплементационной группы В
DDB1 и DDB2 - субъединицы белка UV-DDB, связывающего УФ-повреждённую ДНК
ERCC - ген группы перекрёстной комплементации
Flu-dUMP - 5-{3-[6-(карбоксиамидофлуоресцеинил)амидокапромоил] аллил1}-2’-
дезоксиуридин-5’-монофосфат
Сеп2 -центрин
HR23A - человеческий гомолог А белка Rad23 S.cerevisiae HR23B - человеческий гомолог В белка Rad23 S.cerevisiae PCNA - ядерный антиген клеточной пролиферации
взаимодействия белок : ДНК. В более поздних исследованиях in vivo на
флуоресцентномеченых белках был сделан вывод о том, что ХРА мигрирует к месту повреждения в виде мономера. Для этих экспериментов были использованы химерные структуры ХРА, содержащие флуоресцентные белки GFP или CFP. Размер GFP или CFP составляет 35 и 66 кДа соответственно, что равно или больше размера ХРА и поэтому на таком «фоне» было очень сложно оценить размер мигрирующих частиц.
ХРА способен связывать с небольшой селективностью ДНК, содержащую УФ-повреждения и объёмные адцукты [158]. По сравнению с ХРС, ХРА обладает на порядок меньшим сродством к ДНК-дуплексам, несущим повреждение [131]. Однако оно значительно увеличивается в присутствии RPA [29, 30] и/или ERCC1 [159]. С помощью сканирующей атомно-силовой микроскопии было показано, что связывание ХРА приводит к изгибанию структуры ДНК приблизительно на 42° [122].
Сродство ХРА к нарушениям структуры ДНК в виде неспаренных оснований, петель и «пузырей» делает этот белок схожим с ХРС [157]. Удивительное сродство ХРА к перекрещивающимся молекулам ДНК, а также сходство с |3-шпилечными доменами ХРС, предполагает, что локализация ХРА в открытом комплексе находится вблизи перехода оц-дц ДНК [118, 157, 160].
1.8.2.4. Локализация факторов RPA и ХРА на повреждённой ДНК
Поскольку предполагалось, что ХРА является первым фактором, узнающим
повреждение, делалось множество попыток определить его сайт связывания с ДНК, содержащей повреждение. Использование метода нуклеазного расщепления ДНК ДНКазой I в присутствии ХРА, не дало ожидаемых результатов (например, [85]). Следует отметить, что изначально предполагалось, что ХРА взаимодействует с повреждённой цепыо ДНК-дуплекса. Добавление в реакционную смесь RPA также приводило к равномерному ингибированию процесса расщепления. Метод расщепления ДНК в присутствии исследуемых факторов дал результаты только на ДНК-субстратах, содержащих «пузыри» и петли в случае RPA [144] и в случае ХРА - на структурах «Y-формы» [161]. Для RPA был получен ожидаемый результат - белок локализовался в одноцепочечной области. Результат, полученный для ХРА, подтвердил, что белок связывается с развилкой - переходом оц-дц ДНК, однако, область, защищаемая от нуклеазного расщепления, достаточно велика - 7 нуклеотидов в дуплексной части и 12 нуклеотидов в одноцепочечной. Вероятно, что это соответствует связыванию не одной, а двух - четырёх молекул ХРА.