Исследование биосинтеза белков, жизнеспособности и дифференцировки мононуклеарных клеток пуповинной крови человека, трансфицированных рекомбинантными нуклеиновыми кислотами

• Автор: Салафутдинов, Ильнур Ильдусович
• Шифр специальности: 03.03.04, 03.01.04
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2012
• Место защиты: Казань
• Количество страниц: 183 с. : ил.

ОГЛАВЛЕНИЕ
СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ
ВВЕДЕНИЕ
ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ
1.1 Перенос рекомбинантных нуклеиновых кислот
1.1.1 Плазмидные конструкции как векторы для переноса генетической информации
1.2 Факторы роста
1.2.1 Фактор роста фибробластов
1.2.2 Фактор роста эндотелия сосудов
1.3 Нейродегенеративные заболевания
1.3.1 Моделирование нейродегенеративных заболеваний
1.4 Генная терапия нейродегенеративных заболеваний
1.5 Клеточная терапия нейродегенеративных заболеваний
1.5.1 Эмбриональные стволовые клетки
1.5.2 Мезенхимная стволовая клетка красного костного мозга
1.5.3 Стволовые клетки пуповинной крови
1.6. Генетическая модификация стволовых клеток для генно-клеточной терапии
1.6.1 Нейротрансгшантация генетически модифицированных стволовых клеток
ГЛАВА 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ
2.1 Методы создания рекомбинантных генетических конструкций
2.1.1 Полимеразная цепная реакция (ПЦР)
2.1.2 Гидролиз ДНК специфическими эндодезоксирибонуклеазами
2.1.3 Дефосфорилирование нуклеиновых кислот
2.1.4 Лигирование фрагментов нуклеиновых кислот
2.1.5 Электрофорез в агарозном геле
2.1.6 Очистка продуктов ПЦР реакции и рестрикционных фрагментов
2.1.7 Выделение нуклеиновых кислот (ДНК)
2.1.8 Определение первичной нуклеотидной последовательности ДНК
(секвенирование)
2.2 Методы работы с прокариотическими клетками
2.2.1 Бактериальные штаммы
2.2.2 Трансформация бактериальных клеток

2.3 Методы работы с эукариотическими клетками
2.3.1 Клеточные типы, культивирование
2.3.2 Перенос рекомбинантных нуклеиновых кислот в клетки (трансфекция)
2.3.3 Анализ эффективности трансфекции клеток
2.3.4 Оценка активности митохондриальных дегидрогеназ в эндотелиальных клетках in vitro
2.4 Методы анализа экспрессии рекомбинантных белков in vitro
2.4.1 Иммуноцитохимический анализ
2.4.2 Иммуноблоттинг
2.5 Методы исследования экспрессии генов
2.5.1 Выделение нуклеиновых кислот (РНК) из клеточных культур
2.5.2 Реакция обратной транскрипции
2.5.3 Количественная оценка экспрессии мРНК генов с помощью полимеразной цепной реакции в реальном времени
2.6 Опыты на животных
2.6.1 Объект исследования
2.6.2 Трансплантация генетически модифицированных клеток
2.7. Иммуногистохимические методы
2.7.1 Подготовка образцов тканей для иммуногистохимического исследования
2.7.2 Иммуногистохимическое исследование
2.8 Программное обеспечение и статистическая обработка результатов
ГЛАВА 3. РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ
3.1 Создание плазмидных конструкций, кодирующих кДНК генов
vegfl21, vegfl65, vegf!89,fgf2 и egfp
3.1.1 Создание экспрессионных векторов на основе pcDNA3.1(+)
3.1.2 Создание двухкассетных экспрессионных векторов на основе pBudCE4
3.2 Анализ экспрессии мРНК клонированных генов и биосинтеза рекомбинантных белков
3.2.1 Количественная оценка экспрессии мРНК клонированных генов
3.2.2 Анализ биосинтеза рекомбинантных белков
3.3 Влияние биосинтеза и секреции рекомбинантных белков на пролиферацию клеток HUVEC in vitro

3.4 Исследование свойств генетически модифицированных мононуклеарных клеток пуповинной крови человека in vivo
3.4.1 Трансфекция клеток мононуклеарной фракции пуповинной крови человека
3.4.2 Оценка экспрессии мРНК рекомбинантных генов в генетически модифицированных клетках пуповинной крови человека с помощью ПНР в реальном времени
3.4.3 Ксенотрансплантация генетически модифицированных мононуклеарных клеток пуповинной крови человека трансгенным
животным с фенотипом бокового амиотрофического склероза
ГЛАВА 4. ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ
ЗАКЛЮЧЕНИЕ
ВЫВОДЫ
СПИСОК ИСПОЛЬЗОВАННОЙ ЛИТЕРАТУРЫ
ПРИЛОЖЕНИЕ

установлено, что гепарин необходим для FGF, чтобы эффективно активировать FGFR клеток, которые неспособны синтезировать гепарансульфат протеогликан, или в клетках, предварительно обработанных гепарин/гепарансульфат-деградирующими энзимами или ингибиторами сульфатирования. Мутации в энзимах, участвующих в биосинтезе гепарансульфата, влияют на пути передачи сигналов FGF во время развития. Показано также, что гепарин/гепарансульфат действуют, чтобы увеличить сродство и период полужизни FGF-FGFR комплекса (Itoli & Omitz, 2011).
1.2.2 Фактор роста эндотелия сосудов
Фактор роста эндотелия сосудов (от англ. Vascular Endothelial Growth Factor, VEGF) был первоначально описан как сосудистый фактор проницаемости (от англ. Vascular Permeability Factor, VPF) (Dvorak et al., 1997), который, как было показано впоследствии, проявляет специфическую митогенную активность в отношении эндотелиальных клеток (Ferrara et al., 1992).
На данный момент семейство VEGF насчитывает семь структурно родственных членов: VEGF-A, VEGF-B, VEGF-C, VEGF-D, VEGF-E, VEGFF и PLGF. Представители семейства VEGF-А были обнаружены у всех изученных видов позвоночных, причем их нуклеотидные последовательности высоко консервативны при межвидовом сравнении. Отмечается, что VEGF-А иглобрюха включает 213 аминокислотных остатка в последовательности на 68% гомологичной VEGFigg человека и на 69,7% VEGF188 мыши (Gong et al., 2004). VEGF-A был найден у костистых рыб (Danio reno, Fiigu rubripes), лягушек (Xenopus laevis), птиц (Gallus gallus), млекопитающих (Homo sapiens, Rattus norvegicus, Sus scrofa, Canis familiaris и др.). VEGF-подобные белки найдены и у беспозвоночных (Drosophila melanogaster, Caenorhabditis elegans, Podocoryne carnea) (Holmes & Zachary, 2005).