Влияние экспрессии гена мембранной H+-пирофосфатазы Rhodospirillum rubrum на уровень солеустойчивости растений табака

• Автор: Дьякова, Елена Владимировна
• Шифр специальности: 03.01.06, 03.01.03
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2012
• Место защиты: Москва
• Количество страниц: 123 с. : ил.

ОГ ЛАВЛЕНИЕ
СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ
ВВЕДЕНИЕ
I ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ
1.1 Солевой стресс как фактор среды
1.2 Повреждающее действие солей
1.2.1 Повреждение ультраструктуры растительных клеток
1.2.2 Изменение биохимических процессов
1.2.3 Изменения динамики транспорта и накопления ионов
1.2.4 Влияние засоления на физиологические процессы и морфологию растений
1.3 Механизмы адаптации растений к солевому стрессу
1.3.1 Синтез осмопротекторов как стратегия избегания осмотического эффекта соли
1.3.2 Ионное гомеостатирование цитоплазмы клетки
1.4 Пирофосфатазы
1.4.1 Растворимые пирофосфатазы
1.4.2 Мембранные пирофосфатазы
1.5 Генетическая трансформация как один из способов повышения
солеустойчивости растений
II МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
2.1 Материалы и методы, использованные в работе по конструированию
бинарного вектора
2.2 Методы ведения культуры in vitro
2.3 Методика получение трансгенных растений табака
2.4 Молекулярно-биологический анализ растений
2.4.1 Методика выделение ДНК из листьев растений
2.4.2 Методика проведения ПЦР-анализа растительного материала
2.4.3 Методика проведения Вестерн-блот анализа
2.5 Определение всхожести семенного материала растений табака на средах с
различным содержанием хлорида натрия
2.6 Определение влияния различных концентраций хлорида натрия на рост и
развитие растений
2.7 Определение уровня накопления натрия и калия в тканях растений
2.8 Определение влияния экспрессии гена RPP на рост и развитие растений
условиях in vivo
2.9 Определение содержания хлорофилла в листьях растений
2.10 Статистическая обработка данных
III РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ
3.1 Конструирование бинарного вектора, обеспечивающего экспрессию гена Н
пирофосфатазы Rhodospirillum rubrum
3.2 Получение и анализ трансгенных растений табака, экспрессирующих ген
мембранной Н+-пирофосфатазы Rhodospirillum rubrum
3.2.1 Молекулярно-биологический анализ полученных первичных трансформантов. Выявление наличия гена R.PP в геноме полученных первичных трансформантов

табака
3.2.2 Адаптация растений к условиям in vivo и получение семенного материала
3.2.3 Определение всхожести семян контрольных и трансгенных растений,
экспрессирующих ген Н+-пирофосфатазы R rubrum на средах с различным содержанием хлорида натрия
3.2.4 Определение влияния различных концентраций хлорида натрия на рост и развитие
контрольных и трансгенных растений в условиях in vitro
3.2.5 Определения уровня накопления натрия и калия в тканях контрольных и трансгенных растений табака, экспрессирующих ген Н -пирофосфатазы R. rubrum
3.2.6 Изучение влияния экспрессии гена мембранной Н+-пирофосфатазы R. rubrum на рост
и развитие растений в грунте
3.2.7 Содержание суммарного хлорофилла в контрольных и трансгенных растениях

IV ЗАКЛЮЧЕНИЕ
V ВЫВОДЫ
VI СПИСОК ПУБЛИКАЦИЙ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ
VII СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ
RPP ген, кодирующий мембранную FT -пи р о ф о с ф ат азу
R. rubrum
Ваг ген, кодирующий фосфинотрицинацетилтрансфе-
разу и обеспечивающий устойчивость к гербициду L-фосфинотрицину СЬ - карбенициллин
Cf - цефотаксим
Km - канамицин
Rf - рифампицин
ppt - фосфинотрицин
БАП (ВАР) - 6-бензиламинопурин
НУК (NAA) - нафтилуксусная кислота
ИУК(1АА) - индолил-3-уксусная кислота
ПЦР - полимеразная цепная реакция
Hf - протон (ион водорода)
АТФ - аденозинтрифосфат
АДФ - аденозиндифосфат
АФК - активные формы кислорода
НАДФ - никотинамидадениндинуклеотидфосфат
УДФ - уридиндифосфат
ПФ (РР) - пирофосфат
НСР - наименьшая существенная разность
р факт - фактическое значение критерия (F) Фишера
Fxeop - теоретическое значение критерия (F) Фишера
MS - среда Мурасиге и Скуга (Murashige and Skoog)
pH - водородный показатель
кДа - киллодальтон (атомная единица массы)
Др - градиент электрохимического потенциала
OD - оптическая плотность
мкл - микролитр
л - литр
мл - миллилитр
М - моль
мМ - миллимоль
°С - градусы по Цельсию

бактерий и архебактерий и изучено в гораздо меньшей степени [Zyryanov et al, 2002].
1.4.1.1 Растворимые пирофосфатазы семейства
К настоящему времени проанализировано 37 последовательностей пи-рофосфатаз семейства I [Teplyakov et al., 1994; Zyryanov et al., 2002]. В соответствии с размером и первичной структурой, они могут быть разделены на три подсемейства: пирофосфатазы прокариотические, растительные, и пирофосфатазы животных и грибов, имеющие 162-220, 211-216, и 280-290 аминокислотных остатков на субъединицу, соответственно.
Процент гомологии между последовательностями прокариотических пирофосфатаз составляет 23-99%, у пирофосфатаз растений - 74-90%, у пи-рофосфатаз животных и грибов - 42-95%. Растительные пирофосфатазы имеют тот же тип делеций, что и прокариотические, и похожи на них больше, чем на пирофосфатазы животных и грибов. На филогенетическом древе они представляют отдельную группу, близкую к прокариотическим пирофосфа-тазам. Степень идентичности между растительными и прокариотическими пирофосфатазами находится в диапазоне от 27 до 49%, в то время как между растительными и животными пирофосфатазами составляет от 20 до 29% [Zyryanov et al., 2002].
Субъединицы прокариотических пирофосфатаз значительно меньше, чем субъединицы животных и грибов. Кроме того, прокариотические пирофосфатазы семейства I, как правило, являются гомогексамерами, и устроены как димер из тримеров, тогда как животные и грибные пирофосфатазы гомо-димерны. Несмотря на различные степени гомологии в последовательностях, все пирофосфатазы, рассмотренные выше, имеют одну и ту же структурную упаковку и консервативный активный центр и могут быть рассмотрены как члены одного семейства.