Взаимодействие клатрина с внутриклеточным адаптером TRIP8b

• Автор: Попова, Надежда Викторовна
• Шифр специальности: 03.01.03
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2012
• Место защиты: Москва
• Количество страниц: 83 с. : ил.

Оглавление
Введение
Обзор литературы
1.1. Б-белоксопряжённые рецепторы
1.2. Семейство адгезионных рецепторов
1.2.1. Кальций-независимые рецепторы латротоксина 01*1
1.3. Эндоцитоз Б-белоксопряжённых рецепторов после связывания с лигандом
1.4. Механизм клатрин-опосредованного эндоцитоза
1.5. Основные белки, участвующие в клатрин-опосредованном эндоцитозе
1.5.1. Киназы Б-белоксопряжённых рецепторов и Р-арестины
1.5.2. Клатрин
1.5.3. Адаптерные белковые комплексы АР
1.5.4. Ауксилин
1.5.5. Н5С70
1.6. Другие белки, взаимодействующие с клатрином
1.7. Характеристика белка ТШР8Ь
Экспериментальная часть
2.1. Материалы
2.2. Методы
Результаты исследований и их обсуждение
3.1. Связывание ТИ1Р8Ь с С-концевой частью рецептора С1Рё
3.2. Поиск и идентификация белков, взаимодействующих с ТЙ1Р8Ь
3.3. Определение в молекуле ТИ1Р8Ь участка, отвечающего за связывание с
клатрином
3.4. Влияние мутаций сайтов связывания с клатрином в молекуле ТЯ1Р8Ь на
поверхностную экспрессию НСЫ1-канала

3.5. Совместная локализация ТШР8Ь с клатрином во внутриклеточных структурах
3.6. ТШР8Ь напрямую взаимодействует с очищенным клатрином
Выводы
Список литературы
Приложение

Введение
Эндоцитоз является фундаментальным процессом, обеспечивающим поступление в цитоплазму внеклеточных или расположенных на мембране макромолекул. Эндоцитоз необходим для поступления в клетку питательных веществ, регуляции активности трансмембранных рецепторов, а также рециркуляции синаптических пузырьков. Основным механизмом, по которому происходит интернализация липидов, белков и макромолекул, является клатрин-опосредованный эндоцитоз.
Так, для обеспечения цикличности процесса передачи сигнала требуется баланс двух явлений - экзоцитоза и эндоцитоза. Экзоцитоз необходим для выброса нейромедиатора в синаптическую щель. В свою очередь, эндоцитоз требуется как для поддержания постоянства поверхности пресинаптической мембраны и повторного заполнения синаптических пузырьков нейромедиатором, так и для повторной активации рецепторов постсинаптической мембраны. Эндоцитоз синаптических пузырьков после сильной стимуляции нейромышечного синапса происходит по клатрин-зависимому механизму.
При эндоцитозе активированных рецепторов по клатрин-зависимому механизму с рецептором взаимодействуют различные белки-адаптеры, в частности адаптерный комплекс АР-2, которые опосредуют связывание мембранных белков с молекулами клатрина, образующими оболочку пузырька. На настоящий момент известны многие адаптерные белки, принадлежащие к разным классам.
Хотя механизм эндоцитоза в общих чертах известен, постоянно появляются новые данные о регуляции этого процесса, и поиск и изучение новых адаптерных белков, которые могут обеспечивать направленность процесса, является актуальной на сегодняшний день задачей.

Антитела и маркеры внутриклеточных структур. Первичные антитела: кроличьи поликлональные антитела к TRIP8b (получение описано далее), кроличьи поликлональные антитела к тяжёлой цепи клатрина (Р1663, Cell Signaling), мышиные моноклональные антитела к тяжёлой цепи клатрина (CBL188, Chemicon) или мышиные моноклональные антитела к N-концу тяжёлой цепи клатрина TD.l (sc-12734, Santa Cruz Biotechnology), мышиные моноклональные антитела к р-адаптину (610381, BD Transduction Laboratories), мышиные моноклональные антитела к а-субъединице АР-2 (610501, BD Transduction Laboratories), мышиные моноклональные антитела к у-субъединице АР-1 (610385, BD Transduction Laboratories), мышиные моноклональные антитела к ЕЕА1 (610456, BD Transduction Laboratories), мышиные моноклональные антитела к синаптофизину (S5768, Sigma). Кроличьи антитела к синаптотагмину (V761) и антитела к легким цепям клатрин любезно предоставил профессор Томас Зюдоф (Т.С. Siidhof), антитела к Caspr любезно предоставил James Salzer. В работе также были использованы антитела против иммуноглобулинов кролика и мыши, конъюгированные с пероксидазой хрена (Jackson ImmunoResearch Laboratories, США). Для окрашивания лизосом использовали краску LysoTracker dye (L7528 Red DND-99, Invitrogen), любезно предоставленную д.б.н., доцентом А.В. Феофановым.
Дрожжевая SR-система. Для скрининга взаимодействующих с C1RL белков использовали библиотеку кДНК мозга крысы, в которой кДНК были встроены в полилинкер дрожжевого экспрессионного вектора pYes2 вслед за нуклеотидной последовательностью, кодирующей сигнал миристилирования (Aronheim, Zandi et al. 1997). Последовательность, кодирующую С-концевую часть р85-субъединицы CIRL-1 ("приманка"), соединенную с укороченным человеческим SOS-белком (hSOS), клонировали в вектор pADNS.