Синтез гетерологичных функционально активных GPCR в клетках метилотрофных дрожжей Pichia pastoris

• Автор: Герасимов, Андрей Сергеевич
• Шифр специальности: 03.01.03
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2012
• Место защиты: Москва
• Количество страниц: 128 с. : ил.

ОГЛАВЛЕНИЕ
СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ
ВВЕДЕНИЕ
Глава 1. Обзор литературы
1.1. Основные сведения о рецепторах, сопряженных с G-белком
1.1.1. Общие представления о рецепторах семейства GPCR
1.1.2. Механизмы активации рецепторов и трансдукции
1.1.3. Физиологическая роль рецепторов, сопряженных с G-белком
1.2. Основные подходы получения мембранных рецепторов
1.2.1. Получение рецепторов из природных источников
1.2.2. Гетерологичная экспрессия генов рецепторов семейства GPCR
1.2.3. Выделение и очистка мембранных белков
1.2.4. Основные методы восстановления липидной среды для мембранных рецепторов
1.3. Заключение
Глава 2. Материалы и методы
2.1. Реактивы и оборудование
2.2. Ферменты и коммерческие наборы
2.3. Штаммы используемых микроорганизмов
2.4. Среды для выращивания E. coli
2.5. Среды для выращивания Р. pastoris
2.6. ДНК манипуляции и компьютерные программы
2.7. Синтетические олигонуклеотиды
2.8. Рекомбинантные плазмиды
2.9. Общие методы генетической инженерии и молекулярной биологии

2.10. Конструирование векторов экспрессии
2.10.1. Конструирование векторов pVR2GPCRHis
2.10.2. Конструирование вектора pVR2aMC2RUis
2.10.3. Конструирование векторов pTSA, pTSAV5, pTSABio
2.10.4. Конструирование векторов pET32aMisticMC2R, pET32aMisticADRB2
2.11. Трансформация векторных конструкций в Р. pastoris
2.12. Бактериальный биосинтез и очистка вариантов АСТН
2.13. Анализ уровня экспрессии генов GPCR
2.14. Культивирование штаммов-продуцентов GPCR
2.15. Получение препаратов мембранной фракции с гетерологичными
hADRb2 и hMC2R
2.16. Культивирование штаммов E. coli - продуцентов liADRb2 и hMC2R
и получение препаратов мембранной фракции
2.17. Подбор условий экстракции hADRb2 и hMC2R
2.18. Выделение hADRb2 и hMC2R
2.19. Очистка hADRb2 и hMC2R
2.20. Оценка гомогенности препаратов солюбилизированных рецепторов
и размера полученных мицелл
2.21. Приготовление альпренолол-сефарозы CL-4B
2.22. Приготовление АСТН-ВЮ-стрептавидин сефарозы
2.23. Аффинная хроматография рецепторов
2.24. Тестирование функциональной активности hMC2R
2.25. Определение константы диссоциации комплекса hMC2R-ACTH
2.26. Определение аутоантител hADRb2
2.27. Статистическая обработка результатов
Глава 3. Результаты и обсуждения

3.1. Общие сведения о рецепторах, используемых в данной работе
3.2. Конструирование экспрессионных векторов для синтеза
ОРСЯ и их лигандов
3.3. Получение штаммов-продуцентов вРСЯ и их общая характеристика
3.4. Оценка факторов, влияющих на синтез и активность вРСЯ
3.5. Получение АСТН и его производных
3.5.1. Разработка гибридной технологии экспрессии АСТН
3.5.2. Особенности бактериального синтеза
3.5.3. Выделение и очистка вариантов АСТН
3.6. Изучение функциональной активности 1гМС2Я рецептора
3.6.1. Тестирование функциональной активности ЬМС2Я рецептора
3.6.2. Определение константы диссоциации рецептора с АСТН
3.6.3. Влияние механизма транслокации рецептора на уровень экспрессии
гена ЬМС2Я в дрожжах и функциональную активность рецептора
3.6.4. Сравнение АСТН-связывающей способности ЙМС2Я рецептора, полученного в бактериальной и дрожжевой
3.7. Выделение и очистка ЬМС2Я и 1іАБЯЬ2
3.7.1. Подбор условий солюбилизации рецепторов
3.7.2. Очистка 1іМС2Я и 1іЛ1ЖЬ2 рецепторов
3.7.3. Аффинная хроматография рецепторов
3.8. Использование гетсрологичного ЬАОЯЬ2 рецептора в медицинских целях
3.8.1. Определение аутоантител ЬАБЯЬ2 рецептора
3.8.2. Изучение взаимодействия аутоантител с ЬАВЯЬ2 в присутствии лекарственных субстанций
ВЫВОДЫ
СПИСОК ЦИТИРУЕМОЙ ЛИТЕРАТУРЫ

гидрофобном хвосте, а также, если детергент ионный. Также известно, что концентрация мицеллообразования снижается за счет повышения ионной силы раствора (особенно, если ПАВ ионный) (Maire et al, 2000). К примеру, ККМ додецилсульфата натрия (SDS) приблизительно составляет 6 мМ, а в растворах, содержащих 150 мМ и 350 мМ хлорида натрия, 1,4 мМ и 0,9 мМ соответственно. Вследствие этого, буфер для выделения рецепторов обычно содержит от 0,5 - 1 М хлорида натрия. Также на величину ККМ оказывает влияние pH раствора, температура, присутствие полярных добавок (спирты, мочевина) (Kumar et al, 2004, Patel et al 2010).
Еще одним важным фактором, который необходимо учитывать при солюбилизации мембранных белков из липидных мембран - агрегационное число (A4). Оно показывает, сколько молекул детергента участвует в образовании мицеллы. При условии известного значения размера и молекулярной массы ПАВ, данный показатель также определяет ее размер, который в свою очередь, влияет на стабильность мембранного белка в ее составе. Если мицеллы имеют размер, который меньше размеров мембранного белка, то его стабилизация происходит не полностью, вследствие чего он агрегирует и теряет свою активность. Если же наоборот, тогда рецептор экранируется коллоидной структурой, из-за чего может происходить сильное изменение хроматографических свойств, что, в особенности, критично для аффинных способов очистки.
Данный фактор также определяется природой ПАВ: A4 выше, если детергент в своем составе содержит большое количество метиленовых групп, а также при добавлении противоионов, в случае ионных детергентов; ниже, если большой размер полярной головки детергента, и в его растворе присутствуют полярные органические добавки (спирты, сахара). Наиболее часто в биохимических исследованиях применяются ПАВ с агрегационным числом от 50 до 100. Однако, широко используемые детергенты, содержащие в своем составе остатки производных желчных кислот (CHAPS, CHAPSO и Big CHAP), имеют значения порядка 10. Важно отметить также и то, что детергенты с низкой величиной A4 имеют тенденцию к образованию пластинчатых мицелл, тогда как с высокими значениями A4 склонны к образованию мицелл сферических форм. В любом случае существует еще и концентрационная зависимость.
Гидрофипъно-липофтъный баланс (ГЛБ) указывает на соотношение заряженных и незаряженных групп, т.е. определяет способность детергента разрушать липидные структуры мембран. Значения ГЛБ лежат в пределах от 0 до 40 (Neugebauer, 1990). Причем если оно ниже 10, то это означает, что детергент плохо растворим в воде, гид-рофобен и применяется обычно как пеногаситель, а если выше 30, то очень активен и