Молекулярно-генетические свойства вакцинного штамма Ленинград-3 вируса паротита

• Автор: Кулак, Михаил Валерьевич
• Шифр специальности: 03.01.03
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2010
• Место защиты: Кольцово
• Количество страниц: 139 с. : ил.

ОГЛАВЛЕНИЕ

СПИСОК ИСПОЛЬЗОВАННЫХ СОКРАЩЕНИЙ

ВВЕДЕНИЕ

1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1.1. Общая характеристика вирусов семейства Paramixoviridae. Классификация. Геном. Морфология. Биологические характеристики. Патогенез. Эпидемиология

1.2. Серодиагностика эпидемического паротита

1.3. Молекулярно-генетическая диагностика эпидемического паротита

1.4. Сравнительная характеристика штаммов вируса паротита, применяемых для производства вакцин. Сероконверсия. Эффективность. Безопасность
1.5. Молекулярно-иммунологические основы вакцинонедостаточности при вакцинации против эпидемического паротита

1.6. Заключение по обзору литературы

2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

2.1 Материалы
2.2. Методы
2.2.1. Культивирование вируса паротита
2.2.2. Концентрирование и очистка вирусных антигенов
2.2.3 Выделение суммарной PITK из биологических образцов
2.2.4. Реакция обратной транскрипции
2.2.5. Получение ДНК-фрагментов генома вируса с помощью ПЦР
2.2.6. Очистка продуктов амплификации
2.2.7. Гидролиз эндонуклеазами рестрикции
2.2.8. Реакция лигирования
2.2.9. Метод плазмидиой трансформации клеток E.coli
2.2.10. Скрининг клонов-грансформантов E.coli методом ПЦР
2.2.11. Выделение плазмидной ДНК
2.2.12. Определение нуклеотидных остатков ДНК
2.2.13 Анализ нуклеотидных последовательностей
2.2.14 Иммунизация мышей вакциной против вируса паротита
2.2.15 Получение биологических образцов сывороток крови животных
2.2.16. Получение биологических образцов сывороток крови людей
2.2.17. Получение лимфоцитов от лиц, привитых вакциной против вируса паротита

2.2.18. Взятие глоточных смывов у животных
2.2.19. ИФА Определение антител класса IgM и IgG
2.2.20. Реакция нейтрализации
2.2.21. Реакция бласттрансформации лимфоцитов человека
2.2.22 Оценка продукции у-ИФН лимфоцитами человека, иммунизированных вакциной
вируса паротита в ELISpot анализе
2.2.23. Статистический анализ данных
3. РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ
3.1. Молекулярно-генетический контроль гомогенности и стабильности производственных серий вакцинного штамма Л
3.2. Выбор диагностического участка для молекулярной дифференциации поствакцинальных осложнений при применении вакцины на основе штамма Л-3 и L-' Zagreb от «диких» штаммов вируса паротита
3.3. Получение рекомбинантной плазмиды, содержащей полноразмерный ген HN вируса паротита штамма Л
3.4. Иммунизация мышей вакцинным штаммом Л-3 вируса паротита
3.5. Определение РНК в слюне и крови у добровольцев, привитых вакциной на основе штамма Л
3.6. Исследование случаев заболевания вирусом эпидемического паротита у людей
3.7. ОТ-ПЦР с образцами СМЖ, полученными от внешне здоровых людей, а также
пациентов с диагнозами гнойный (не вирусный) менингит и клещевой энцефалит
ЗАКЛЮЧЕНИЕ
ВЫВОДЫ
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ
Приложение
Приложение
СПИСОК ИСПОЛЬЗОВАННЫХ СОКРАЩЕНИЙ
CDC - (Centers for Disease Control and Prevention) - Центр по Конролю и Предотвращению Заболеваний
FDA - (Federal Drug Administration) - Федеральное агентство по контролю за медикаментами и пищевыми продуктами США IgG - иммуноглобулины класса G IgM - иммуноглобулины класса М
МНС - (major histocompatibility complex) - главный комплекс гистосовместимости
AM - асептический менингит
а.о. - аминокислотные остатки
ВН - вакцинная недостаточность
ВВН - вторичная вакцинная недостаточность
ВОЗ - Всемирная Организация Здравоохранения
ИФА - иммуноферментный анализ
кДНК - комплементарная РНК копия ДНК
КЭ - куриные эмбрионы
КЭЯП - культура клеток эмбрионов японских перепелов
Л-3 - Ленинград
н.о. - нуклеотидные остатки
ОТ - обратная транскрипция
ОП - оптическая плотность
ПВН - первичная вакцинная недостаточность
ПЦР - полимеразная цепная реакция
РКЭ - развивающиеся куриные эмбрионы
PH - реакция нейтрализации цитопатического действия вируса РТГА - реакция торможения гемагглютинации СМЖ - спинномозговая жидкость
ТЦПД5()- титр вируса, обеспечивающий разрушение 50% инфицируемых клеток
ЦНС - центральная неврная система
ЦПД - цитопатическое действие
ЭДТА - этилендиаминтетраацетат
ЭП - эпидемический паротит

Но, с другой стороны, показано, что вакцинация более 90% населения вакциной против эпидемического паротита, является достаточным для благоприятной эпидемической обстановки (WHO.INT 09/2004).
Таким образом, остается крайне интересной проблема формирования протективного иммунитета, в частности, поиск ключевых факторов иммуногенности, необходимых для обеспечения протективного уровня среди популяции людей. Вполне возможно, что формирование высокоавидного пула антител (нейтрализующих антител), зависит не только от аллельного набора HLA индивида или группы индивидуумов, но и от представленности антигенных эпитопов на самом вирусном антигене.
1.6. Заключение по обзору литературы
В настоящее время основная проблема, связанная с применением противопаротитных вакцин - это все увеличивающееся количество вспышек заболевания ЭП, несмотря на высокую вакцинацию населения и проводимые противоэпидемические мероприятия. Причиной данного явления может быть то, что вирус «дикого» типа довольно долго циркулировал среди высоко иммунизированной популяции людей, что привело к давлению естественного отбора со стороны вакцинированного населения и в результате появились штаммы, способные поражать людей, имеющих антитела против вируса ЭП. В связи с чем, следует по-новому отнестись к исследованию иммуногенности и протективности существующих вакцин и, в особенности, их безопасности. Поскольку после применения противопаротитных вакцин основным осложнением является AM, то существует необходимость создания стандарта по диагностике и исследованию случаев AM (Bonnet МС, et. al., 2006). Недостатками применяемых в настоящее время методов является их высокая стоимость и необходимость в высокотехнологичном оборудовании и высококвалифицированном персонале. Метод ОТ-Г1ЦР, предложенный ранее группой авторов (Palacios G, et. al., 2005), по определению содержания РНК вируса паротита в спинномозговой жидкости (СМЖ), может быть использован для диагностики заболевания