Кристаллизация и исследования структуры фактора инициации трансляции 2 из эукариот и архей

• Автор: Архипова, Валентина Ивановна
• Шифр специальности: 03.01.03
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2015
• Место защиты: Москва
• Количество страниц: 135 с. : ил.

ОГЛАВЛЕНИЕ
СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ
ВВЕДЕНИЕ
ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ
ИНИЦИАЦИЯ ТРАНСЛЯЦИИ У АРХЕЙ
1. Сравнительная характеристика системы инициации трансляции у бактерий, эукариот и архей
2. Архейные факторы инициации трансляции
2.1. alFl
2.2. alFlA
2.3. aIF
2.4. alF5B
2.5. alF
Заключение
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
1. Материалы и приборы
1.1. Химические реактивы и ферменты
1.2. Буферы и среды
1.3. Бактериальные штаммы и плазмиды
1.4. Принадлежности
1.5. Приборы
2. Методы генной инженерии и микробиологии
2.1. Клонирование генов субъединиц e/aIF
2.2. Метод сайт-направленного мутагенеза последовательности ДНК
2.3. Электрофорез ДНК в геле агарозы
2.4. Обработка ДНК сайт-специфическими эндонуклеазами рестрикции
2.5. Получение компетентных клеток E. coli с применением хлорида кальция
2.6. Трансформация клеток E. coli плазмидной ДНК методом теплового шока
2.7. Экспрессия генов субъединиц e/aIF2 в клетках E. coli
3. Биохимические методы при работе с белками
3.1. Препаративное выделение и очистка у-субъединицы aIF2 S. solfataricus и ее
мутантных форм из клеток штаммов-суперпродуцентов E. coli
3.2. Препаративное выделение и очистка aIF2a, aIF2aD3> aIF2ctD23, aIF2ß
S. solfataricus из клеток штаммов-суперпродуцентов E. coli
3.3. Препаративное выделение и очистка гетеротримера alF2 S. solfataricus из
клеток штаммов-суперпродуцентов E. coli
3.4. Препаративное выделение и очистка eIF2a и elF2ß S. cerevisiae из клеток
штаммов-суперпродуцентов E. coli
3.5. Получение препаратов комплексов e/aIF

3.6. Спектрофотометрическое определение концентраций белков
3.7. Электрофорез белков в ПААГ в присутствии ДСН
3.8. Электрофорез белков в ПААГ в нсдснатурирующих условиях в кислой среде.
3.9. Кристаллизация aIF2y и ее мутантных форм в свободной и
нуклеотид-связанных формах
4. Биохимические методы при работе с РНК и нуклеотидами
4.1. Получение и очистка фрагментов мРНК
4.2. Препаративное выделение и очистка инициаторной тРНК E. coli из клеток
штамма-суперпродуцента
4.3. Аминоацилирование тРНК
4.4. Электрофорез РНК в ПААГ в денатурирующих условиях
4.5. Препаративная очистка нуклеотидов
4.6. Анализ чистоты препаратов нуклеотидов
4.7. Спектрофотометрическое определение концентраций нуклеиновых кислот и
нуклеотидов
5. Биохимические методы при работе с РНК-белковыми комплексами
5.1. Получение мРНК-белковых комплексов
5.2. Электрофорез РНК-белковых комплексов в ПААГ
5.3. Электрофорез РНК-белковых комплексов в геле агарозы
5.4. Анализ РНК-белковых комплексов методом поверхностного плазмоиного
резонанса
5.5. Получение и препаративная очистка тройственных комплексов
alF2*GDPNP*Mct-TPHKr и e/aIF2*GDPNP*Met-TPHKf
5.6. Кристаллизация тройственных комплексов alF2*GDPNP*Met-TPHKf и
e/alF2*GDPNP*Met-TPHKf
РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ
1. Получение и кристаллизация архейного тройственного комплекса aIF2*GDPNP»Met-тРНКг
2. Выделение субъединиц eIF2 S. cerevisiae
3. Получение и кристаллизация химерных форм фактора e/alF2 и их тройственных комплексов e/aIF2*GDPNP*Met-TPHKf
4. Исследование мРНК-связывающих свойств alF2y S. solfataricus
5. «Рабочий» цикл aIF2y S. solfataricus
ВЫВОДЫ
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ
БЛАГОДАРНОСТИ

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ
а. о. - аминокислотный остаток БСА - бычий сывороточный альбумин ДСН - додецилсульфат натрия ДТТ - 1,4-дитиотреитол
ИПТГ — изопронил-р-В-тиогалактопиранозид
ММЭПЭГ - монометиловый эфир полиэтиленгликоля
МПД - 2-метил-2,4-пентандиол
и.о. — нуклеотидный остаток
НТО - нетранслируемая область
о. е. - оптическая единица
ПААТ - полиакриламидный гель
ПАК - полиакриловая кислота
ПЦР - полимеразная цепная реакция
ТЕМЕД - N, N, N', N' - тетраметил этилендимамин
Трис - трис-(гидроксиметил)-аминометан
Ф„ - неорганический фосфат
ЭДТА - этилендиаминтетрауксусная кислота
CTD - С-концевой домен
D1 - домен 1, D2 - домен 2, D3 - домен
FMT - формиат-ион
GDPCP - гуанозин-5-(Р,у-метилен)-трифосфат GDPNP - гуанозин-5'-ф,у-имидо)-трифосфат
Hepes - Ы-2-гидроксиэтилпиперазин-Ы'-2-этансульфоновая кислота
1RES — внутренний участок посадки рибосом
MANT-GDP - (2 73')-0-(М-метилантранилоил)гуанозин-5 '-дифосфат
MES - 2-(Т4-морфолино)этансульфоновая кислота
NDSB - неденатурирующий сульфобетаин
NTD - JV-концевой домен
PMSF - фенилметилсульфонилфторид
SPR - поверхностный плазмонный резонанс
SRL - сарцин-рициновая петля
Р-МЭ - р-меркаптоэганол
наблюдалось ON положение switch 2, а петля switch I принимала конформацию не характерную для ON и OFF состояний. Было предположено, что в полученной структуре switch участки принимают конформации, соответствующие состоянию alF2y непосредственно после гидролиза ГТФ, когда неорганический фосфат (Ф„) еще остается связанным с белком. Позднее с помощью молекулярной динамики были рассчитаны изменения свободной энергии возможных переходов из СЖ:ГТФ в ОМ':ГДФ состояние alF2y и показано, что белок с промежуточной ON/OFF конформацией switch участков действительно может являться функциональным интермедиатом (Satpati and Simonson, 2012).
На основании кристаллических структур фактора EF-Tu в комплексе с Рhe-тРИК1’1"' и нерасщепляемым аналогом ГТФ (GDPNP) (Nissen et al., 1995, 1999), а также структур ay-димера (Yatime et al., 2006) и у-субъединицы alF2 (Schmitt et al., 2002; Nikonov et al., 2007) были предложены две модели тройственных комплексов alF2 с ГТФ и инициаторной тРНК, которые в дальнейшем не подтвердились. Кристаллические структуры двух тройственных комплексов (полноразмерного - alF2a()y*GDPNP*Met-тРНКг и неполноразмерного - alF2au3Y,GDPNP*Mct-TPHK1) были определены французской (Schmitt et al., 2012) и нашей группами (Stolboushkina et al., 2013), соответственно. Эти данные будут подробно описаны в результатах данной диссертационной работы.
Другим важным направлением в изучении свойств e/alF2 является исследование расположения тройственного комплекса е/аПД'ГТФ'МеМ'РНК, на малой рибосомной субчастице. Методом фотоактивируемого ковалентного связывания было зафиксировано ковалентное присоединение а- и у-субъединиц elF2 к 18S рРИК (Westermann et al., 1980). С помощью электронной микроскопии с использованием антител к субъединицам eIF2, было показано расположение eIF2 в районе «шеи» малой рибосомной субчастицы со стороны, контактирующей с большой субчастицей (Bommcr et al., 1988). Согласно данным химического пробинга в 48S прсиницнаторном комплексе S. cerevisiae домен III elF2y располагается вблизи А1655-А1671 и U1735-A1750 н. о. спирали h44 18S рРНК (Shin et al., 2011а). Кроме того, в составе 48S комплекса в результате фотоактивируемого ковалентного связывания были получены сшивки eIF2a с нуклеотидным остатком в положении -3 относительно стартового кодона мРНК (Pisarev et al., 2006). С использованием метода белок-белковых сшивок и последующей идентификации сшитых продуктов с помощью иммуноблотинга и масс-спектрометрии было показано взаимодействие 1 домена eIF2ct с белком S5 (uS7 согласно номенклатуре Ban et al., 2014) (Sharifulin et al., 2013).