Новые функции белков семейства Noggin: ингибирование сигнальных каскадов Activin/Nodal и Wnt в эмбриональном развитии

• Автор: Ерошкин, Федор Михайлович
• Шифр специальности: 03.01.03
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2012
• Место защиты: Москва
• Количество страниц: 163 с. : ил.

Оглавление
Î. Введение
2. Обзор литературы
2.1. Общие принципы эмбриональной индукции. Нейральная индукция
2.2. Сигнальный каскад TGF-(3
2.2.1. Суперсемейство TGF-(3
2.2.2. Каскад Activin/Nodal
2.2.3..Внеклеточная регуляция Activin-каскада
2.2.4. Рецепторы Activin
2.2.5. Регуляция рецепторов Activin
2.2.6. Регуляция сигнального каскада Activin через белки Smad
2.2.7. Гены-мишени Smad2 каскада
2.2.8. Smad-независимый сигнальный путь Activin и перекрестное действие рецепторов
2.2.9. Роль Activin и TGF-|3 в канцерогенезе
2.2.10. Activin и стволовые клетки
2.2.11. Каскад BMP
2.2.12. Функции BMP
2.2.13. Внеклеточная регуляция ВМР-каскада
2.2.14. Внутриклеточная регуляция ВМР-каскада
2.2.15. Гены-мишени Smadl- (BMP-) каскада
2.3. Сигнальный каскад Wnt
2.3.1. Классификация активностей Wnt лигандов
2.3.2. Канонический путь Wnt (Wnt/(3-Catenin)
2.3.3. Планарная клеточная полярность (PCP)
2.3.4. Неканонический Wnt/Ca2+ путь
2.3.5. Секреция Wnt и внеклеточные регуляторы
2.3.6. Wnt-индуцированные клеточные ответы
2.4. Эволюционное происхождение сигнальных каскадов TGF-|3 и Wnt
2.5. Взаимодействие сигнальных каскадов в раннем развитии Xenopus
2.6. Регионализация нервной трубки в ходе эмбриогенеза
2.7. Семейство белков Noggin
2.7.1 Функциональная роль Noggin
2.7.2. Структура Noggin
2.7.3. Noggin как ингибитор BMP
2.7.4. Белок Noggin человека (HNoggin)
2.7.5. Мутации гена Noggin

3. Полученные результаты
3.1. Клонирование и анализ последовательностей новых белков семейства Noggin
3.2. Изучение локализации экспрессии генов Noggin в раннем развитии шпорцевой лягушки
3.3. Изучение эффектов эктопической экспрессии генов Nogginl и -2 в раннем развитии шпорцевой лягушки
3.4. Изучение эффективности трансляции мРНК генов Nogginl и -2 в эмбрионах шпорцевой лягушки
3.5. Изучение лиганд-связывающих свойств белков Nogginl и
3.6. Nogginl и Noggin2 способны ингибировать активность Activin/Nodal- и Wnt-каскадов в живых эмбрионах
3.7. Nogginl и Noggin2 способны влиять на онтогенетические процессы, контролируемые Activin/Nodal- и Wnt- каскадами в эмбрионах
3.8. Активность Noggin2, но не Nogginl, необходима для нормального эмбрионального развития Xenopus
3.9. Ингибирование Activin-каскада посредством Noggin2 необходимо для развития переднемозговых структур
4. Обсуждение результатов
4.1. TGF-P лиганды (помимо BMP) и Wnt являются мишенями белков семейства Noggin
4.2. Ингибирование Activin-, BMP- и Wnt-каскадов посредством Noggin2 необходимо для развития переднемозговых структур
5. Выводы

6. Материалы и методы
6.1. Материалы
6.1.1 Реактивы
6.1.2. Ферментные препараты
6.1.3. Лабораторное оборудование
6.1.4. Лабораторные животные
6.1.5. Буферы и растворы
6.1.6. Микробиологические среды
6.1.7. Предоставленные штаммы
6.1.8. Предоставленные плазмиды
6.2. Методы
6.2.1. Амплификация ДНК при помощи полимеразной цепной реакции (ПЦР)
6.2.2. Электрофорез в агарозном геле
6.2.3. Элюция ДНК из агарозного геля
6.2.4. Расщепление ДНК эндонуклеазами рестрикции
6.2.5. Достройка З'-конца двухцепочечных молекул ДНК
6.2.6. Отщепление выступающего 3'- конца двухцепочечных молекул ДНК
6.2.7. Лигирование молекул ДНК
6.2.8. Трансформация клеток Escherichia coli
6.2.9. Выделение плазмидной ДНК из бактерий Escherichia coli
6.2.10. Изготовление плазмидных ДНК конструкций
6.2.11. Транскрипция in vitro
6.2.12. Получение зародышей шпорцевой лягушки Xenopus laevis
6.2.13. Синтез белков в ооцитах или зародышах Xenopus laevis
6.2.14. Электрофоретическое разделение белков в денатурирующих условиях в ПААГ
6.2.15. Иммуноблот (Western Blotting)
6.2.16. Изучение белок-белковых взаимодействий в системе in vivo с помощью метода коиммунопреципитации
6.2.17. Блокирование трансляции эндогенных мРНК при помощи микроинъекций синтетических антисмысловых олигонуклеотидов
6.2.18. Фиксация зародышей
6.2.19. Гибридизация in situ на целых эмбрионах шпорцевой лягушки
6.2.20. Синтез дигоксигенин-меченной антисмысловой РНК для проведения гибридизации in situ
6.2.21. Экстракция тотальной РНК из зародышей шпорцевой лягушки
6.2.22. Обратная транскрипция и полимеразная цепная реакция (ОТ-ПЦР)
6.2.23. Обратная транскрипция и полимеразная цепная реакция (ОТ-ПЦР) в реальном времени
6.2.24. Измерение люциферазной активности специфических репортеров
8. Список сокращений

7. Благодарности
9. Список использованной литературы

BMP, данный каскад активируется также белками ADMP (Anti-Dorsalizing Morphogenetic Protein) и GDF (Growth and Différenciation Factors). Рецепторы ActRII обладают широкой специфичностью. Но, хотя ActRlI - рецептор высокой аффинности и для Activin, и для ВМР-7, он, как и BMPRII, обладает низкой аффинностью к ВМР-2 (Greenwald et al. 2003).
2.2.13. Внеклеточная регуляция ВМР-каскада
На внеклеточном уровне каскад BMP регулируется целым рядом секретируемых белков: Chordin, Chordin-подобные (chordin-like) белки, Noggin, Follistatin, FSRP, sclerostin, белки семейства DAN/Cerberus, Gremlin и др.
Chordin является крупным белком (примерно 1000 а.о.) и несет в своем составе четыре цистеин-богатых домена (CRI - CR4, от Cysteine-Rich) размером около 70 а.о. каждый (Larrain et al. 2000). Кристаллическая структура Chordin или CR не известна, но предполагается наличие цистинового узла (Avsian-Kretchmer and Hsueh 2004). CR-повторы, также называемые факторами фон Виллебранда С (von Willebrand factor С domains, vWF-C), также имеются у большого количества внеклеточных белков, большинство из которых участвует в регуляции BMP- или TGF-ß-сигналов. Это CTGF (Connective Tissue Growth Factor), проколлагены, Amnionless, Chordin-like/Ventroptin/Neuralin-1 и -2, CRIM-1 (Cysteine-Rich Motor neuron protein), Nel (белок нервной ткани, содержащий EGF-подобные домены), Nel-like 1 и 2, Keilin и Crossveinless-2 (Garcia Abreu et al. 2002). Chordin экспрессируется на дорсальной стороне эмбриона Xenopus, определяя дорсо-вентральную разметку зародыша (см. ниже). Генетический нокаут гена Chordin у мыши вызывает вентрализацию гаструлы, однако, у очень небольшого процента эмбрионов. У них наблюдается уменьшение размеров нервной трубки и увеличение аллантоиса (Bachiller et al. 2003). У большей части эмбрионов chd нервная система формируется нормально, но они погибают при рождении. Аномалии у chd~/~ мышей напоминают синдром Ди Джорджи человека, вызванный отсутсвием экспрессии Chordin в глоточной энтодерме на поздних эмбриональных стадиях (Bachiller et al. 2003). У эмбрионов мышей, генетически нокаутированных по гену Noggin, гаструляция и формирование нервной пластинки