Молекулярные инструменты для модуляции редокс-статуса и мониторинга активности нейронов

• Автор: Матлашов, Михаил Егорович
• Шифр специальности: 03.01.03
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2014
• Место защиты: Москва
• Количество страниц: 105 с. : ил.

ОГЛАВЛЕНИЕ
ОГЛАВЛЕНИЕ
ВВЕДЕНИЕ
ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ
1.1 Синаптическая передача электрического сигнала и её регуляция
1.1.1 Молекулярные основы синаптической передачи
1.1.2 Синаптические структуры как самостоятельные клеточные компартменты
1.2 Регуляция pH в нейронах и его влияние на синаптическую проводимость
1.2.1 Влияние электрической активности на pH в нейронах
1.2.2 Регуляция pH в мозге
1.2.3 Влияние цитоплазматического pH на синаптическую активность
1.3 Активные формы кислорода и их роль в функционировании нейронов
1.3.1 Биология активных форм кислорода
1.3.2 Источники активных форм кислорода в нейронах
1.3.3 Антиоксидантные системы нейронов
1.3.4 Влияние активных форм кислорода на синаптическую активность нейронов
1.3.5 Участие активных форм кислорода в развитии нейродегенеративных заболеваний
1.4 Способы регистрации и модуляции метаболической и электрической активности в нейронах
1.4.1 Способы мониторинга pH в нейронах
1.4.2 Детекция уровня активных форм кислорода в нейронах
1.4.3 Система для направленной продукции пероксида водорода
ЦЕЛИ И ЗАДАЧИ
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
2.1 Материалы
2.1.1 ДНК-Вектора
2.1.2 Реактивы и расходные материалы для клонирования
2.1.3 Оборудование и программное обеспечение для клонирования
2.1.4 Эукариотические клеточные линии, культуральные среды и расходные материалы
2.1.5 Оборудование для работы с клеточными линиями
2.1.6 Оборудование и програмное обеспечение для имаджинга
2.1.7 Использованные для имаджинга химические вещества
2.2 Методы
2.2.1 Получение генетических конструкций

2.2.2 Культивирование и трансфекция клеточных линий Не1.а и N11-1/
2.2.3 Выделение и трансфекция первичной эмбриональной культуры гипокампальных нейронов
2.2.4 Флуоресцентная микроскопия
2.2.5 Калибрование индикаторов по pH
2.2.6 Компьютерная обработка изображений
Результаты и обсуждение
3.1 Регистрация динамики pH в нейронах
3.1.1 Разработка генетически кодируемого индикатора с повышенной яркостью в клетках
3.1.2 Характеристика динамики значения цитоплазматического pH в диссоциированной культуре нейронов
3.1.3 0Р1 вызывает закисление цитоплазмы нейронов
3.1.4 Получение синаптических конструкций с5урНег
3.1.5 Экспрессия 5урНег2 в короткоживущих срезах мозга мыши
3.2 Система для контролируемой локальной продукции пероксида водорода
3.2.1 Оксидаза О-аминокислот может продуцировать пероксид водорода в ответ на добавление О-аланина к клеткам
3.2.2 Продукция пероксида водорода в нейронах
ВЫВОДЫ
ЗАКЛЮЧЕНИЕ
СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

ВВЕДЕНИЕ
Достижения современных методов молекулярной биологии и флуоресцентной микроскопии сделали нейробиологию одной из самых быстроразвивающихся наук. Применение генетически кодируемых флуоресцентных индикаторов и методов оптогенетики делают возможным мониторинг и даже управление физиологическими процессами отдельных нейронов мозга, функционирующего в режиме реального времени. Несомненно, технология продолжает развиваться, и разработка новых молекулярных инструментов для регистрации и модуляции нейрональной активности востребована как в фундаментальных, так и в прикладных исследованиях.
Биохимические процессы, протекающие в нейронах, одновременно весьма сложны и интересны для изучения. Прямым следствием физиологической функции нейронов - генерации, обработки и передачи электрических сигналов - является высокая динамичность параметров внутриклеточной среды. В процессе генерации электрического сигнала внутриклеточная концентрация ионов Иа+, К+, Са2+ меняется на порядки, причём весь этот процесс занимает лишь несколько миллисекунд. В свою очередь, активация Ыа+/К+, Н+ и Са2+ АТРаз для поддержания ионных градиентов требует больших затрат энергии и ускорения процессов катаболизма. Поддержание баланса между процессами жизнедеятельности и функционирования нейронов требует наличия тонкой системы регуляции этих процессов.
Известно, что транспорт ионов Са2+ и ускорение процессов катаболизма, сопровождающие повышенную электрическую активность, могут вызывать закисление цитоплазмы нейронов. Значение pH является одним из важнейших параметров внутренней среды клеток, так как оно влияет на структуру, активность и взаимодействие многих клеточных белков, следовательно, на эффективность протекания многих метаболических процессов, скорость ионного транспорта и др. Электрическая активность нейронов не является исключением. Так, проводимость ЫМЭА рецепторов и потенциал-чувствительных кальциевых каналов подавляется подкислением цитоплазмы нейронов, транспорт нейромедиаторов в синаптические везикулы происходит по градиенту pH и т.д. Отсюда следует, что модуляция клеточного pH может являться одним из механизмов регуляции синаптической передачи нейронов.
Другим не менее важным параметром внутриклеточной среды является окислительно-восстановительный статус клетки. С тех пор, как было обнаружено, что клетки практически всех тканей животных организмов способны продуцировать активные формы кислорода и использовать их в регуляции важнейших клеточных процессов от дифферен-
показали участие активных форм кислорода, продуцируемых митохондриями в ответ на стимуляцию глутаматом, в регуляции выброса дофамина через ингибирование АТР-зависимых К+-каналов [66].
Наконец, молекула пероксида водорода, продуцируемые в нейронах, может диффундировать в соседние клетки, в том числе астроциты и олигодендроциты, которые также влияют на развитие и электрическую активность нейронов. Так, стимуляция гиппокампальных нейронов приводит к АФК-зависимому фосфорилированию основного белка миелина в олигодендрацитах, которое блокируется антиоксидантами и ингибиторами N0-синтазы [177]. Это способствует миелинизации нервных волокон, увеличивая их электрическую проводимость.
Таким образом, окислительно-восстановительная регуляция синаптической активности может происходить на многих уровнях: непосредственное действие на активность каналов или модуляция активности регуляторных белков, контролирующих активность, локализацию и синаптических белков и экспрессию их генов. Вместе с тем, роль различных участников этого регуляторного процесса до сих пор остаётся во многом загадочной. Неясно, почему характер окислительно-восстановительной регуляции меняется с возрастом, как связаны между собой продукция пероксида Ж)Х и митохондриями, играет ли роль продукция пероксида в синапсах на проводимость соседних и т.д. К тому же, во многих моделях уровень пероксида водорода в клетке повышался путём добавления внеклеточной перекиси или системы ксантин/ксантиноксидаза, которые не позволяют различать, например, эффекты, оказываемые АФК на пост- и пресинаптические окончания или на отдельные синапсы. Мы уверены, появление новых индикаторов пероксида, ингибиторов его источников, а также инструментов для направленной продукции пероксида будет способствовать быстрому разрешению этих вопросов.
1.3.5 Участие активных форм кислорода в развитии нейродегенеративных заболеваний
Как уже упоминалось выше, хотя АФК и могут выполнять регуляторную роль, они являются токсичными молекулами, способными вызывать значительные повреждения ДНК, белков и других клеточных структур. Так, окислительный стресс может вызывать дисфункцию эндотелия сосудов, воспаление, апоптоз, нарушения клеточной миграции, фиброз и другие нарушения сердечнососудистой системы [112]. В нервной системе эти нарушения играют особенно существенную роль, где повышение продукции АФК или нарушение их утилизации, вызванные старением, болезнями или травматическими повреж-