Генетически кодируемый фотосенсибилизатор как инструмент воздействия на жизнеспособность и скорость пролиферации клеток эукариот

• Автор: Серебровская, Екатерина Олеговна
• Шифр специальности: 03.01.03
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2011
• Место защиты: Москва
• Количество страниц: 125 с. : ил.

ВВЕДЕНИЕ
ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ
Механизмы фотосенсибилизации
Фотофизика
Фотохимия
Молекулярные механизмы программируемой клеточной смерти при
фотодинамической терапии
Апоптоз
Каспаз-независимый апоптоз
Автофагия
Некроз
Внутриклеточной локализации фотосенсибилизатора на механизм
ФОТОДИНАМИЧЕСКОГО ВОЗДЕЙСТВИЯ
Лизосомы и лизосомные катепсины как медиаторы клеточной гибели,
вызванной окислительным стрессом
Эндоплазматическийретикулум как мишень фотодинамического
воздействия
Ядро как мишень фотодинамического воздействия
Механизм повреждения ДНК при фотосенсибилизации
Клеточный ответ на повреждение ДНК
Сверочные точки клеточного цикла
Сверочная точка 01/8
Сверочная точка Б-фазы
Сверочная точка сборки веретена деления
Использование клинически значимых фотосенсибилизаторов для
индукции окислительных повреждений в ядре
Направленная доставка к опухолевым клеткам
Антитела для направленной доставки
Иммуноконъюгаты
Конъюгаты антител с радионуклидами
Конъюгаты антител с химиотерапевтическими агентами
Конъюгаты антител с белковыми токсинами
Направленная доставка фотосенсибилизаторов с помощью
моноклональных антител
Влияние антигена
Влияние антитела
Формат антител
Антитело 4Б5 - история создания и характеристики
Влияние свойств опухоли

Прямое и непрямое воздействие фотосенсибилизатора на опухоль
Фотоиммуноконъюгаты
Фотоиммуноконъюгаты для детекции опухолей
Фотоиммуноконъюгаты для терапии опухолей
ФОТОАКТИВНЫЕ ФЛУОРЕСЦЕНТНЫЕ БЕЛКИ И ГЕНЕТИЧЕСКИ КОДИРУЕМЫЙ ФОТОСЕНСИБИЛИЗАТОР KiLLERRED
ЦЕЛИ И ЗАДАЧИ РАБОТЫ
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
Материалы
Методы
Генетические конструкции
Выделение плазмидной ДНК
Трансформация клеток E.coli методом электропорации
Электрофорез ДНК в агарозном геле
Экстракция ДНК из агарозного геля после электрофоретического
разделения
Культивация штаммов-продуцентов E.coli, индукция
Вертикальный гель-электрофорез в ПААГ в денатурирующих условиях... 52 Вертикальный гель-электрофорез в ПААГ для визуализации
флуоресцентных белков
Вестерн-блот анализ
Выделение белка на Ni-NTA-сефарозе
Эксклюзионная хроматография (гель-фильтрация)
Обессоливание белков с помощью колонок NAP5 и PD10 (Amerscham
Biosciences, носитель сефадекс G25M)
Клеточные линии и условия культивирования
Флуоресцентно-микроскопический анализ
Анализ жизнеспособности клеток, МТТ-тест
Временная трансфекция эукариотических клеток
Лентивирусная трансдукция эукариотических клеток
Стерильная проточная сортировка клеток и проточная
цитофлуориметрия
Анализ клеточного цикла с помощью окрашивания йодистым пропидием и
проточной цитофлуориметрии
Модифицированный клоногенный метод с подсчетом числа клеток в
индивидуальных колониях
Метод оценки фото-цитостатического воздействия методом прямого
подсчета с внутренним контролем
Манипуляции с эмбрионами X.laevis
РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

Генетически кодируемый иммунофотосенсибилизатор
Экспрессия, выделение и очистка рекомбинантного белка 4D5 scFv-
KillerRed-His5
Характеристика специфичности связывания 4D5-KillerRed-His}
Фототоксичность рекомбинантного белка 4D5-KillerRed-Hiss
Тандем фототоксического белка KillerRed в составе белка слияния с
КОРОВЫМ ГИСТОНОМ Н2В ВЫЗЫВАЕТ ВРЕМЕННУЮ ОСТАНОВКУ КЛЕТОЧНОГО ЦИКЛА.

Задержка клеточного деления при облучении
Механизм, обеспечивающий задержку клеточного деления при облучении
интерфазных клеток
Механизм, обеспечивающий нерасхождение хромосом при облучении
метафазных клеток
Использование H2B-tKR для нарушения развития тканей in vivo
Лизосомы как мишень фототоксического воздействия KillerRed
ЗАКЛЮЧЕНИЕ
СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ103
Статьи
Тезисы докладов на конференциях
СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ
ПРИЛОЖЕНИЕ 1. СТРАТЕГИЯ ВЫБОРА РЕГИОНОВ (ГЕЙТИРОВАНИЯ) ПРИ ПРОТОЧНО-ЦИТОФЛУОРИМЕТРИЧЕСКОМ АНАЛИЗЕ КЛЕТОЧНОГО ЦИКЛА
ПРИЛОЖЕНИЕ 2. СХЕМЫ ГЕНЕТИЧЕСКИХ КОНСТРУКЦИЙ С Н2В-TKR, ПОЛУЧЕННЫХ В ДАННОЙ РАБОТЕ

дисульфидными связями; Fab - фрагменты; миниантитела [124]. Однако, в связи с различием в природе используемых антигенов и моделей опухолей непосредственное сравнение различных форматов по эффективности нацеливания достаточно пробелматично. Таким образом, на данном этапе не существует убедительных данных в поддержку преимуществ полноразмерных антител, или тех или иных фрагментов антител, для фотоиммунотерапии. Выбор в каждом отдельном случае зависит от свойств конкретного антитела и
vpv/ X VVIIVIIV/HJIIUIH U/Ич
Антитело 4D5 - история создания и характеристики
В 1987 году были впервые получены моноклональные антитела к внеклеточному домену рецептора HER2/neu (путем иммунизации мышей клетками NIH ЗТЗ, трансфицированными кДНК IIER2/neu и гиперэкспрессирующими рецептор HER2/neu) [128]. Одно из полученных антител - антитело 4D5 - обладало несколькими интересными биологическими характеристиками и было выбрано для последующего изучения. Антитело 4D5 специфически иммунопреципитировало белок FIER2/neu и не реагировало с человеческим рецептором эпидермального фактора роста (EGFR, или FIERI) даже на клетках, гиперэкспрессирующих HER1. Существуют данные, свидетельствующие о том, что данное антитело узнает специфическую конформацию рецептора HER2/neu, образующуюся после его гликозилирования [129]. Кроме того, Hudziak и соавторы показали, что полученное ими антитело ингибирует рост клеток SKBR-3 (аденокарциномы молочной железы) - максимальные полученные показатели ингибирования роста составили 56%.
Затем антитело 4D5 было гуманизировано на основании данных, полученных с помощью молекулярного моделирования [130]. Таким образом была повышена его потенциальная клиническая эффективность (путем снижения иммуногенности и модификации константных регионов для увеличения антитело-зависимой клеточной цитотоксичности). Полученное гуманизированное антитело связывало антиген в 3 раза эффективнее, чем его мышиный аналог, и ингибировало пролиферацию клеток SKBR-3 с той же эффективностью.
Была также создана Р(аЬ’)г-форма антитела (humAb4D5-8 F(ab’)2, Mr=96 кДа, которая ингибировала пролиферацию клеток SKBR-3 с равной эффективностью [130]. Антитело 4D5 оказалось настолько стабильным и удачным с точки зрения эффективности экспрессии в E.coli, что его структура в дальнейшем использовалась для создания антител различной специфичности с помощью замены участков, отвечающих за специфичность к антигену. Например, с помощью замены на CDR, специфичный к флуоресцеину, было