Комплексы полупроводниковых нанокристаллов и рекомбнантных антител для флуоресцентной визуализации опухолевых клеток

• Автор: Здобнова, Татьяна Александровна
• Шифр специальности: 03.01.03
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2011
• Место защиты: Москва
• Количество страниц: 90 с. : 38 ил.

ОГЛАВЛЕНИЕ
СПИСОК СОКРАЩЕНИИ
ВВЕДЕНИЕ
ГЛАВА I ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ
ВВЕДЕНИЕ
I.Iï КТ как флуоресцентные визуализирующие агенты для молекулярной1 диагностики опухоли
1.1.1. Строение и свойства КТ
I.I.2. Методы получения водорастворимых КТ
I.I.3. Метод присоединения биологических молекул
1.1.3.1. Присоединение непосредственно к полупроводниковой части нанокристалл а
I.I.3.2. Присоединение к гидрофильному покрытию
I.I.4. Нацеливание КТ на опухолевые клетки
1.1.4.1. Направляющие агенты
1.1.4.2. Методы присоединения направляющих агентов к КТ
1.1.4.3. Проблема неспецифического связывания КТ
I.I.5. Диагностика in vitro
I.I.5.I. Визуализация опухолевых клеток
1.1.5.2. Одновременная детекция нескольких онкомаркеров
I.I.5.3. Иммуногистохимический анализ
1.1.5.4. Наблюдение в реальном времени за молекулярными процессами и клетками
I.I.6. Визуализация in vivo на модельных животных
I.L6.1. Детекция опухолей с использованием КТ
I.I.6.2. Биораспределение и фармакокинетика КТ
I.I.7. Риск применения КТ в биомедицинских исследованиях ■
1.1.7.1. Цитотоксичность КТ
1.1.7.2. Системная токсичность in.vivo
I.Hi Антитела как направляющие модули в диагностике опухолей'
1.П.1. Форматы антител, используемых как направляющие модули в диагностике опухолей
I.II.2. Основные методы мультимеризации антител
1.П.З. Факторы, влияющие на выбор антител для доставки визуализирующих модулей in vivo
ЗАКЛЮЧЕНИЕ
ГЛАВА II МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
II.I. Материалы и оборудование
II.II. Методы исследования-
ГЛАВА III РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ
1П.1. Общаястратегия. Обоснование выбора компонентов для создания направленных флуоресцентных комплексов.
111.1.1. Выбор визуализирующего модуля
Ш.1.2. Выбор направляющего модуля
1П.П. Разработка методов связывания КТ с антителами формата ьсРт

Ш.11.1. Получение рекомбинантных антител 4D5scFv и 425scFv
ГО.П.2. Разработка метода прямой конъюгации КТ с направляющими антителами 4D5scFv
UI.II.2.1. Получение конъюгатов 4D5scFv с КТ, модифицированных МУК
IIIII.2.2. Получение конъюгатов 4D5scFv с КТ, покрытыми полимером
Ш.П.З. Разработка подхода к связыванию КТ с направляющими антителами через систему BBS
Ш.П.З.1. Получение и характеристика белков BBS, а также направляющих модулей 425scFv-Bn и 4D5scFv-Bn-4DscFv
Ш.П.З.2. Получение визуализирующих модулей: конъюгация белков BBS с КТ SO
Ш.П.З.3. Получение флуоресцентных комплексов водорастворимых КТ с рекомбинантными противоопухолевыми антителами
Ш.Ш. Изучение взаимодействия флуоресцентных конструкций на основе КТ с опухолевыми>клетками in,vitro.
Ш.Ш.1. Проблема неспецифического связывания КТ с клетками
Ш.Ш.2. Специфическое окрашивание опухолевых клеток комплексами на основе BBS
in.IV. Барназа-барстар как универсальная система для создания флуоресцентныхкомплексов направленного действия на основе КТ
III.TV. 1. Преимущества системы молекулярных адапторов барназа-барстар для создания комплексов на основе КТ
III.IV.2. Примеры использования системы молекулярных адапторов барназа-барстар для включения КТ в состав сложных надмолекулярных структур
III.IV.2.1. Получение флуоресцентных конструкций с использованием полимерных микросфер, сенсибилизированных КТ
III.IV.2i2. Получение многофункциональных наноконструкций на основе BBS с использованием конъюгатов КТ
III.V. Изучение цнтотоксичностн КТ и комплексов, полученных на их основе
IILVI. Визуализация опухолей в организме in vivo с использованием КТ н их комплексов с рекомбинантными антителами •
III.VI.1. Прижизненная визуализация опухолей
III.VI.2. Изучение распределения КТ и их комплексов с рекомбинантными антителами в органах и тканях 108'
ЗАКЛЮЧЕНИЕ
ВЫВОДЫ
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ
а. о. - аминокислотный остаток;
АФК - активные формы кислорода;
БСА - бычий сывороточный альбумин;
ГД - гидродинамический диаметр;
ЕА - единица активности;
ИГХ - иммуногнстохимический анализ;
ИК - инфракрасный;
ИФА - иммуноферментный анализ;
КТ - квантовые точки (флуоресцентные полупроводниковые нанокристаллы);
МУК - меркаптоуксусная кислота;
ОЕ - оптические единицы;
ОФД - орл/о-фенилендиаминдигидрохлорид;
ПААГ - полиакриламидный гель;
ПЭГ - полиэтиленгликоль;
РЭС - ретикуло-эндотелиальная система; у. е. - условная еденица;
УФ - ультрафиолетовый;
APS - персульфатаммония;
BBS - система молекулярных адаптеров барназа-барстар {англ., bamase-barstar system); BCIP - 5-бромо-4-хлоро-3-индолил-фосфат;
DMSO - диметилсульфоксид;
DTT - дитиотриэтол;
ED AC - гидрохлорид1-этил-3-(3-диметиламинопропил)-карбодиимида;
EDTA - динатриевая соль этилендиаминотетрауксусной кислоты;
IPTG - изопропил-l-Tiio-B-D-галактозид;
МТТ - 3-(4,5-диметилтиазол-2-ил)-2,5-дифенилтетразолиумбромид;
NBT - нитротеразолий синий;
NHSS - натриевая соль N-гидроксисульфосукцинимида; scFv - одноцепочечный вариабельный фрагмент антитела;
SDS - додецилсульфат натрия;
TEMED - М,К,М,Х-тетраметилэтилендиамнн.

показано, что оба флуорофора позволяют специфически визуализировать опухоль молочной железы, однако КТ существенно хуже выводятся из организма, накапливаясь в органах РЭС.
Первоначальные результаты работ, посвященных исследованию влияния размера и свойств поверхности КТ на их распределение в организме после внутривенного введения довольно противоречивы. Так, в ряде исследований было показано, что поверхностное покрытие [Fischer et al., 2006; Schipper et al., 2009] и размер [Schipper etal., 2009] сильно влияют на фармакокинетику и биораспределение частиц. С другой стороны, в систематическом исследовании ]Hauck. et al:, 2010]- проведенном с одновременным учетом всех факторов, которые могут влиять на биораспределение, не наблюдалось каких-либо значимых различий между КТ разного размера, с разным зарядом и наличием или отсутствием на поверхности различных молекул (альбумин, ПЭГ) - все КТ накапливались в первую очередь в печени и селезенке.
КТ могут выводиться из организма двумя, путями: через почки и через печень [Fischer et al.; 2006, Ballou et al., 2004]. Путь выведения в наибольшей степени зависит от двух параметров частиц: размера и поверхностного покрытия,- определяющего склонность к адсорбции белков сыворотки крови [Frangioni. et al., 2003]. Изучение выведения из организма специально созданных серий КТ различного размера и с различным покрытием [Choi е* all, 2010]шоказало, что одним из обязательных критериев для полного выведения наночастиц из- организма через почки является их ГД менее 5:5• нм (т.е. ниже порога почечной фильтрации). На сегодняшний день все синтезированные КТ с флуоресценцией-в красном и ближнем ИК-диапазоне, используемые для визуализации in vivo, имеют больший размер (около 10 нм) и в принципе не могут выводиться через почки. Кроме того, эти КТ покрыты, полимером для лучшей стабильности и содержат на поверхности заряженные функциональные группы и ПЭГ, что еще больше увеличивает их размер. Так, например,-ГД широко используемых коммерческих КТ производства Invitrogen- 15-19 нм [Kobayashi.et al:, 2007]. Для таких больших небиодеградируемых КТ остается только один путь выведения из организма - через печень, в составе желчи. Это очень медленный и неэффективный, процесс, а долговременное пребывание наночастиц в органах . РЭС повышает возможность разрушения оболочки КТ и возникновения,токсического эффекта. Таким образом, для КТ, идеально подходящих по своим прочим (кроме гидродинамического диаметра) характеристикам для визуализации опухолей in vivo, накопление в печени, селезенке и других органах РЭС неизбежно. Интересно, что некоторые авторы отмечали в почках накопление КТ с ГД, значительно превышающим порог почечной фильтрации [Hauck et al., 2010; Yang et al., 2007]. Без проведения