Характеристика рекомбинантного штамма Salmonella enteritidis E23/pcDNA-TCI, несущего ДНК-вакцину против ВИЧ-1, и исследование его иммуногенных свойств в составе суппозиториев

• Автор: Даниленко, Алексей Валерьевич
• Шифр специальности: 03.01.03
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2012
• Место защиты: Кольцово
• Количество страниц: 107 с. : ил.

СОДЕРЖАНИЕ
Введение
Основные положения, выносимые на защиту
Научная новизна и практическая ценность
Личный вклад автора
Публикации и апробация работы
Публикации по теме диссертации
Глава 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ
1. Вирус иммунодефицита человека первого типа
1.1. Строение вириона. Жизненный цикл вируса
1.2. Вакцины против ВИЧ/СПИДа
1.2.1 Живые аттенуированные вакцины
1.2.2. Инактивированные вакцины и вирусоподобные частицы
1.2.3. Субъединичные вакцины
1.2.3.1. Нативные Env вакцины
1.2.3.2. Вакцины на основе модифицированного белка Env
1.2.3.3. Вакцины на основе Tat- белка
1.2.4. Полиэпитопные иммуногены для индукции Т- и В-клеточного 27 иммунного ответа против ВИЧ
1.2.5. ДНК-вакцины как способ доставки Т- клеточных полиэпитопных 28 иммуногенов
1.2.6. Обоснование перспективности создания мукозальной вакцины 31 против ВИЧ
1.2.7. Доставка иммуногенов с помощью аттенуированных штаммов 33 сальмонелл
1.2.8. Суппозитории для доставки лекарственных средств и 38 микроорганизмов
Глава 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
2.1. Материалы
2.1.1. Реактивы
2.1.2 Ферменты
2.1.3. Плазмиды
2.1.4. Бактериальные штаммы
2.1.5. Культуральные и питательные среды
2.2. Методы
2.2.1. Трансформация клеток аттенуированного штамма S. enteritidis Е23 44 методом электропорации
2.2.2. Выделение плазмидной ДНК методом щелочного лизиса
2.2.3. Гидролиз плазмидной ДНК эндонуклеазами рестрикции
2.2.4. Электрофорез фрагментов ДНК в агарозном геле
2.2.5. Культивирование и идентификация аттенуированных штаммов 45 сальмонелл на дифференциальных агаризованных питательных средах
2.2.6. Серотипирование аттенуированных штаммов сальмонелл с 46 помощью агглютинирующих сывороток
2.2.7. Оценка стабильности плазмиды pcDNA-TCI в составе S. enteritidis 46 E23/pcDNA-TCl in vitro
2.2.8. Метод оценки патогенности S. enteritidis Е23 и S. enteritidis 47 E23/pcDNA-TCI
2.2.9. Приготовление суппозиториев, содержащих лифилизированные 48 клетки аттенуированного рекомбинантного штамма S. enteritidis Е-23/ pcDNA-TCI
2.2.10. Изучение персистенции штаммов штаммов S.enteritidis Е23 и 49 S enteritidis E23/pcDNA-TCI в организме лабораторных животных
2.2.11. Анализ экспрессии гена TCI по уровню синтеза специфической 50 мРНК после иммунизации мышей суппозиториями, содержащими Salmonella enteritidis Е-23/ pcDNA-TCI
2.2.12. Получение рекомбинантного белка TCI
2.2.13. Определение количества специфических цитотоксических 51 лимфоцитов в селезенке иммунизированных животных с помощью реакции ELISPOT
2.2.14. Иммуноферментный анализ сывороток иммунизированных 52 животных на наличие специфических IgG антител к TCI
2.2.15. Иммуноблотинг с использованием тест-системы «New-Lav-blotl»
2.2.16. Иммуноферментный анализ сывороток иммунизированных 53 животных на наличие специфических IgA антител к TCI
2.2.17. Статистическая обработка результатов
Глава 3. РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ
3.1. Характеристика рекомбинантного штамма S. enteritidis E23/pcDNA- 55 TCI
3.2.Оценка патогенности S. enteritidis Е23 и 5. enteritidis E23/pcDNA-TCI
3.3. Оценка стабильности плазмиды pcDNA-TCI в составе S. enteritidis 64 E23/pcDNA-TCI in vitro
3.4. Персистенция штаммов S.enteritidis E23 и S.enteritidis E23/pcDNA- 66 TCI в организме лабораторных животных, иммунизированных суппозиториями. Оценка стабильности плазмиды pcDNA-TCI в составе
S. enteritidis E23/pcDNA-TCI in vivo
3.5. Доказательство экспрессии гена, кодируемого pcDNA-TCI, in vivo
3.6. Иммуногенные свойства S. enteritidis E23/pcDNA-TCI в составе 70 суппозиторной формы
3.6.1. Т-клеточный иммунный ответ, индуцированный штаммом 70 S. enteritidis E23/pcDNA-TCI
3.6.2. Гуморальный иммунный ответ, индуцированный штаммом 72 S. enteritidis E23/pcDNA-TCI
3.6.3. Мукозальный иммунный ответ, индуцированный штаммом 76 S. enteritidis E23/pcDNA-TCI
Заключение
Выводы
Благодарности
Список литературы

• мутанты сальмонелл (агоА, агоВ, агоС) по генам, кодирующим белки, участвующие в метаболизме ароматических кислот (Hoiseth and Stöcker, 1981; Dougan et al, 1987);
• аттенуированные штаммы сальмонелл, которые содержали мутации в генах ssct, sse, spt, sop, sip, входящих в кластеры генов SPI-1 и SPI-II (Raupach and Kaufmann, 2001);
о аттенуированный штамм сальмонеллы, который содержал мутации в гене
репликазы ruvB (Choi et al, 2011), и мутант S. choleraesuis, содержащий мутации в rpoS, phoP регуляторных генах (Bartolome et al., 2010);
• мутант по суа и сгр генам (Рыжова и Бойченко, 1997);
• штамм S. typhimurium с мутациями в гене ДНК- аденинметилазы dam. Впоследствии он был использован для разработки вакцины против сальмонеллеза овец (Mohler et al., 2011).
Первые работы по использованию аттенуированных штаммов сальмонелл в качестве вакцин были связаны с доставкой рекомбинантных белков (Carrier et. al., 1992, Stabei et. al., 1990, Brett et. al., 1993, Бойченко и др., 1997). Примеры успешного использования сальмонелл для доставки как бактериальных, так и вирусных антигенов приведены в следующих работах. Рядом авторов было показано, что цитоплазматическая экспрессия гетерологичных белков в штамме S. typhimurium может вызывать протективный иммунный ответ к столбняку (антиген: белковый фрагмент С столбнячного токсина) (Fairweather et al., 1990), Streptococci pyogenes (антиген: M5 белок) (Poirier et al., 1988), Plasmodium berghii (антиген: белок CSP) (Tite et al, 1990) и гриппу (антиген: гемагглютинин вируса гриппа) (Sadoff et al, 1988). Исследования, проведенные на человеке, также подтверждают, что бактериальные антигены, экспрессирующиеся в цитоплазме векторного штамма, могут быть иммуногенными (Nardelli-Haefliger et.al., 1996)
Использование сальмонелл в качестве средства доставки ДНК-вакцин было впервые продемонстрировано в работе Дарджи с коллегами (Darji et al., 1997). В этой работе исследователями был создан рекомбинантный штамм аттенуированной сальмонеллы, содержащий плазмиду с геном листериолизина, экспрессирующимся в клетках эукариот. При иммунизации мышей был получен специфический гуморальный и Т-клеточный иммунный ответ, который обеспечивал защиту