Влияние WNT лигандов на формирование фенотипа клеточных линий меланомы человека

• Автор: Куликова, Ксения Валерьевна
• Шифр специальности: 03.01.03
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2012
• Место защиты: Москва
• Количество страниц: 124 с. : ил.

СОДЕРЖАНИЕ
СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ
ВВЕДЕНИЕ
1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ. ВКЛАД ТОТ СИГНАЛЬНОГО ПУТИ В
ВОЗНИКНОВЕНИЕ И РАЗВИТИЕ МЕЛАНОМЫ
1.1 Лиганды Vrit и их внеклеточные партнеры по взаимодействию
1.2 Пути передачи сигнала, активируемые белками семейства УЫ
1.2.1 Канонический УЫ сигнальный путь
1.2.2 Неканонические Vrit сигнальные пути
1.3 Значение сигнального пути для поддержания гомеостаза кожи
1.4 Роль ¥п1 сигнального пути в формировании и прогрессии меланомы
1.4.1 Роль канонического Vjit сигнального пути при развитии меланомы
1.4.2 Вклад неканонического Viit сигнального пути в метастазирование меланомы
2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
2.1 Ферменты и реактивы
2.2 Плазмидные векторы и клонирование
2.2.1 Создание экспрессионной конструкции, кодирующей лиганд 11¥п15а
2.2.2 Создание №АТ-репортерной системы
2.3 ДНК электрофорез в агарозном геле и ПААГ
2.4 Трансформация клеток Е. соН
2.5 Культивирование клеточных линий
2.6 Выделение тотальной РНК и ПЦР, сопряженная с обратной транскрипцией
2.7 Транзиторная трансфекция культуры опухолевых клеток
2.8 Получение клеточных пулов, стабильно продуцирующих рекомбинантные белки
2.9 Вестерн-блот (иммуноблот) анализ
2.10 Выделение мембрано-связанного пула (3-катенина
2.11 Иммуноцитохимический анализ
2.12 Люциферазный тест
2.13 Определение жизнеспособности и пролиферативной активности клеток
2.14 Тест на восстановление повреждений монослоя
2.15 Статистическая обработка результатов
3. РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ
3.1 Клетки меланоцитарного невуса и клетки линий меланомы человека экспрессируют гены базовых молекулярных компонентов, необходимых для миграции

3.2 Клеточные линии меланомы человека различаются по паттерну экспрессии генов молекулярных компонентов, ассоциированных с подвижностью
3.3 В клеточных линиях меланомы человека отсутствие выраженной ядерной локализации р-катенина не отражает статус активности канонического УТй сигнального пути
3.4 Вариабельность паттерна экспрессии генов транскрипционных факторов ТСЕЛЖТ семейства в клеточных линиях меланомы человека
3.5 Для клеточных линий меланомы человека характерна экспрессия гена неканонического лиганда Vnt5a
3.6 Получение экспрессионных конструкций, кодирующих лиганды Viit
3.7 Экспрессия гена канонического лиганда приводит к накоплению Р-катенина и к активации ТСР/ЬЕР-зависимого промотора в модельной клеточной линии меланомы человека Ме1Р
3.8 В клеточной линии Ме1Р неканонические лиганды ингибируют активацию канонического Wnt сигнального пути, стимулированную Vnt3a, но не ЫС1
3.9 Как неканонические, так и канонический лиганды вызывают усиление миграции клеточной линии меланомы человека Ме1Р
3.10 Неканонический лиганд Vntl 1 стимулирует пролиферацию клеток Ме1Р
3.11 Усиление миграции клеточной линии меланомы человека Ме1Р под действием Vnt3a не связано с активацией канонического Viit сигнального пути
3.12 В клеточной линии Ме1Р лиганды Vnt3a, Vnt5a и Vntl 1 активируют сигнальный путь, связанный с увеличением уровня внутриклеточного кальция
4. ЗАКЛЮЧЕНИЕ

5. ВЫВОДЫ
6. СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

ПРИЛОЖЕНИЕ А

БЛАГОДАРНОСТИ

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ
АТФ Аденозинтрифосфат
ВКМ Внеклеточный матрикс
Да (кДа) Дальтон (килодальтон)
ДСН Додецилсульфат натрия
ДСН-ПААГ Полиакриламидный гель, содержащий додецилсульфат натрия ОТ-ПЦР Полимеразная Цепная Реакция, сопряженная с Обратной
Транскрипцией цАМФ Циклический аденозинмонофосфат
ЭМП Эпителиально-мезенхимальный переход
АРС Adenomatous Polyposis Coli (Аденоматозный полипоз толстой кишки)
CAMKII Ca2+/calmodulin-dependent protein kinase (Кальций/Кальмодулин-
зависимая киназа)
СВР cAMP response element-binding protein (CREB)-Binding Protein
CDR Cysteine-Rich Domain (Цистеин-богатый домен)
CKI Casein kinase 1 (Казеин киназа 1)
ConA ConcanavalinA (Конканавалин A)
CRM1 Chromosome Region Maintenance 1 (Экспортин 1)
Daam-1 Dishevelled-associated activator of morphogenesis 1 (Dishevelled-
ассоциированный активатор морфогенеза 1)
DAG Diacylglycerol (Диацилглицерол)
DAPI 4',6-diamidino-2-phenylindole (4’,6-диамидино-2-фенилиндол)
Dkk Dickkopf
Dvl Disheveled
Fz Frizzled
GAPDH Glyceraldehyde 3-Phosphatc Dehydrogenase
(Глицеральдегид-3-фосфатдегидрогеназа)
GFP Green Fluorescent Protein (Зеленый флюоресцентный белок)
GPCR G-Protein-Coupled Receptor (Рецептор, сопряженный с G-белком)
GSK-3P Glycogen synthase kinase-3(1 (Гликоген синтаза киназа 3(3)
IP3 Inositol( 1,4,5)- trisphosphate (Инозитол( 1,4,5)-трифосфат)
JNK c-Jun N-terminal Kinase (c-Jun N-терминальная киназа)
LRP 5/6 Low density lipoprotein (LDL) receptor-Related Protein 5/6 (Белок,
родственный рецепторам липопротеинов низкой плотности)

ТОБ(3-стимулиро 15а) шая экспрессия генов Мтр-3 и Мтр-14 также требует присутствия Р-катенина [211]. Как и канонический, неканонический ¥п1: сигнальный путь способен направлять клетки-предшественники в коже взрослого организма в сторону осуществления настоящей регенерации ткани. Обработка повреждения ретровирусным вектором, содержащим ген лиганда Wnt-5a, приводит к даже более эффективному образованию кожных придатков в пределах раны, чем в случае стабилизации Р-катенина. При этом активация неканонического УЩ сигнального пути не вызывает образования эпителиальных опухолей. В отличие от Р-катениногово сигнального каскада, чья стимуляция, напротив, часто приводит к появлению подобных новообразований [210].
Развитие и поддержание гомеостаза кожи в значительной степени зависит от регуляции, осуществляемой компонентами УЛй сигнального пути. Этот путь вовлечен в индукцию и спецификацию клеток нервного гребня, в определение судьбы эпидермальных и меланоцитарных стволовых клеток, в формирование волосяного фолликула и в заживление ран. Учитывая столь значимую роль Уп1 сигнального пути в контроле биологических процессов кожи, неудивительно, что нарушения регуляции этого сигнального каскада часто связаны с различными патологическими состояниями. Одним из таких состояний является меланома. Развитие меланомы ассоциировано с изменением паттерна экспрессии многих генов лигандов семейства ¥Щ.
1.4 Роль Viit сигнального пути в формировании и прогрессии меланомы
Нарушение регуляции 'Уп1 сигнального пути часто сопровождает как образование, так и развитие меланомы. Меланому кожи рассматривают как злокачественное образование, происходящее из клеток нервного гребня. Это образование возникает вследствие неопластической трансформации клеток-предшественников меланоцитов или же самих пигмент-продуцирующих клеток. Меланома характеризуется высокой агрессивностью, изменчивостью, а также высокой смертностью пациентов, страдающих этим недугом. Развитие меланомы представляет собой многостадийный процесс. Он включает разрастание и дисплазию врожденного или возникшего с возрастом невуса, стадию радиального роста меланомы (КОР), стадию вертикального роста меланомы (УСР) и, наконец, метастазирование [212]. Неконтролируемая клеточная пролиферация лежит в основе формирования невуса. Полагают, что для дальнейшего возникновения меланомы должна произойти иммортализация клеток невуса [213]. Часть атипичных невусов претерпевает