Структура полноразмерного L1-выступа бактериальной рибосомы. Влияние изменений поверхности контакта рибосомного белка L1 Thermus thermophilus с РНК на его РНК-связывающие свойства

• Автор: Сарских, Алена Витальевна
• Шифр специальности: 03.01.03
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2014
• Место защиты: Пущино
• Количество страниц: 117 с. : ил.

СОДЕРЖАНИЕ
Содержание
Список сокращений
Введение
Обзор литературы
1.1 Кристаллизация рибосом и их субчастиц, кристаллографические
исследования и определение структур
1.2 Малая рибосомная субчастица рибосомы
1.2.1 Структурные и функциональные особенности малой субчастицы
1.2.2 Декодирующий центр
1.2.3 Морфологические элементы малой субчастицы
1.2.4 Структура 30S субчастицы в комплексе с антибиотиками
1.3 Большая рибосомная субчастица
1.3.1 Структура и функциональные центры большой субчастицы рибосомы
1.3.2 Структура РНК большой рибосомной субчастицы
1.3.3 Пептидилтрансферазный центр
1.3.4 ПТЦ - проторибосома
1.3.5 Центр, ассоциированный с ГТФазной активностью (ГАЦ)
1.3.6 Белки большой субчастицы
1.3.7 Структура 50S субчастицы в комплексе с антибиотиками
1.4 Структура 70S рибосомы
1.4.1 Межсубъединичные мостики
1.5 Элонгационный цикл и функциональные центры рибосомы
1.5.1 тРНК-связывающне сайты
1.5.1.1 А-сайт
1.5.1.2 Р-сайт
1.5.1.3 Е-сайт

1.5.2 Инициация
1.5.3 Элонгация и декодирующий центр
1.5.4 Формирование пептидной связи
1.5.5 Транслокация
1.5.6 Терминация
1.5.7 Рибосома — молекулярная машина
1.6 Рибосомный белок L1 как составная часть Ll-выступа и регулятор синтеза белков своего оперона
1.6.1 Белок L1, как составная часть Ll-выступа
1.6.2 Белок L1 - репрессор, ингибирующий трансляцию мРНК своего оперона .
Материалы и методы
2.1 Материалы
2.1.1 Химические реактивы и ферменты
2.1.2 Буферы
2.1.3 Среды
2.1.4 Бактериальные штаммы и плазмиды
2.1.5 Приборы
2.2 Методы
2.2.1 Методы генной инженерии и микробиологии
2.2.1.1 Полимеразная цепная реакция
2.2.1.2 Электрофорез ДНК в агарозном геле
2.2.1.3 Обработка ДНК сайт-специфическими эндонуклеазами
2.2.1.4 Очистка фрагментов ДНК
2.2.1.5 Лигирование ДНК
2.2.1.6 Получение компетентных клеток
2.2.1.7 Трансформация клеток E. coli
2.2.1.8 ПЦР-анализ клонов
2.2.1.9 Выделение и очистка плазмидной ДНК

2.2.1.10 Рестрикция плазмидной ДНК для транскрипции и ее последующая очистка
2.2.1.11 Экспрессия генов белка L1 и его мутантных форм в клетках E. coli
2.2.2 Выделение и очистка белков
2.2.2.1 Выделение белка L1 из клеток E. coli
2.2.2.2 Катионообменная хроматография на смоле CM-Sepharose
2.2.2.3 Аффинная хроматография на смоле Heparin- Sepharose
2.2.2.4 Электрофорез белков в ПААГ в присутствии ДСН
2.2.2.5 Электрофорез белков в ПААГ в неденатурирующих условиях
2.2.2.6 Проверка наличия/отсутствия РНКазной активности в полученном
препарате белка
2.2.3 Выделение и очистка РНК
2.2.3.1 Получение специфических фрагментов рРНК
2.2.3.2 Электрофорез РНК в ПААГ в денатурирующих условиях
2.2.3.3 Электрофорез нуклеиновых кислот в ПААГ в неденатурирующих
условиях
2.2.4 Получение и кристаллизация мутантных форм белка L1 и РНК-белкового
комплекса
2.2.5 Анализ РНК-белковых комплексов методом поверхностного плазмонного
резонанса
2.2.5.1 Биотинилирование фрагментов РНК
2.2.5.2 Модификация поверхности чипа
2.2.5.3 Определение констант ассоциации и диссоциации методом
поверхностного плазмонного резонанса
Результаты и их обсуждение
3.1 Пространственная структура изолированного полноразмерного Ll-выступа рибосомы
3.1.1 Получение и кристаллизация комплекса TthLl-pPHK
3.1.1.1 Клонирование гена специфического фрагмента рРНК
3.1.1.2 Получение фрагмента рРНК

Рис. 8. Примеры роли ионов металла в межсубъединичных мостиках. А. Общий вид межсубъединичных взаимодействий между белками Ы 9 (серый) и 1Л4 (фиолетовый) большой субчастицы и спиралью Ь44 168 рРНК (оранжевый). Ь14 участвует в формировании мостика В5, который взаимодействует со спиралью Й44 16Б рРНК, Ы9 участвует в формировании мостика В6 и также взаимодействует со спиралью Ь44 168 рРНК. Оба белка (1Л9 и 1Л4) формируют мостик В8, контактируя со спиралью Ы4 168 рРНК. 238 рРНК отмечена голубым цветом, белки большой субчастицы отмечены синим, белки малой субчастицы - бежевым, 168 рРНК (за исключением спирали Ь44) отмечена желтым, ионы магния отмечены зеленым (см. также текст). Б. Пример конформационных изменений, индуцированных в мостике В2а связыванием тРНК в А-сайте. В. Мостик, образованный с помощью иона магния. В межсубъединичном мостике В2с сахарофосфатный остов спиралей й24 и Й27 16Б рРНК взаимодействует с Н67 238 рРНК через ион магния. Г. В мостике В5 белок Ы4 контактирует с 16Б рРНК как напрямую, так и через ион магния. Д. В мостике В8 сахаро-фосфатный остов спирали И14 взаимодействует с белками 1Л9 и Ы4 через два иона магния (8е1тег е? а1., 2006).