Изучение взаимодействия РНК-полимеразы с нуклеиновыми кислотами на разных стадиях транскрипционного цикла

• Автор: Членов, Марк Михайлович
• Шифр специальности: 03.01.03
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2010
• Место защиты: Москва
• Количество страниц: 120 с. : ил.

Содержание
Введение

Обзор литературы

Общее строение бактериальной РНК-полимеразы

Структурные элементы кор-фермента

Неконсервативные домены больших субъединиц кор-фермента РНКП

Основные этапы прокариотической транскрипции

Взаимодействия холофермента РНКП с однонитевыми фрагментами ДНК.. 26 . Взаимодействие холофермента РНКП с гибридным промоторным

фрагментом, имитирующим открытый комплекс

Материалы и Методы

Питательные среды и антибиотики:

Получение компетентных клеток и их трансформация
Ферменты, использованные для клонирования
Полимеразная Цепная Реакция (ПЦР)
Очистка фрагментов ДНК
Электрофорез белков и нуклеиновых кислот
Нативный электрофорез ДНК в агарозном геле
Денатурирующий электрофорез ДНК и РНК
Нативный электрофорез белков и белок-ДНКовых комплексов
Денатурирующий электрофорез белков в ПААТ
Клонирование и очистка белков
Очистка и выделение РНКП
Клонирование и экспрессия большого неконсервативного домена РНК-
полимеразы
Очистка НКД ß ‘-субъединицы
Клонирование и очистка РНКП с мутациями в ß -субъединице
Клонирование и очистка НКД ß ‘-субъединицы E.coli
Перманганатный и эндонуклеазные футпринты
Химические сшивки и картирование........................................42 '
Получение ДНК-матрицы с фотоактивной сшивающей группой
Фотоактивная ковалентная ДНК-белковая сшивка
Картирование ДНК-белкбвых сшивок
Кристаллизация и разрешение структуры НКД ß ‘-субъединицы E.coli.
■ Кристаллизация белка
Сбор данных рассеяния
Построение трехмерной модели структуры НКД
Результаты и обсуждение
Изучение ДНК-белковых взаимодействий в промоторном комплексе с помощью олигонуклеотидов с фотохимическими сшивающими группами. ..48 Общее распределение фотохимических сшивок из матричного и
нематричного олигонуклеотидов в субъединицы РНКП
Картирование контактов ст-субъединицы с олигонуклеотидами нематричной
цепи LacUV5 промотора
Картирование контактов ß-субъединицьт с олигонуклеотидами нематричной цепи LacUVS промотора

Картирование контактов ß ‘-субъединицы с олигонуклеотидами нематричной
цепи LacUVS промотора
Анализ распределения фотохимических пришивок в субъединицы
холофермента РНКП
Мутации С-консервативного района ß -субъединицы E.coli и их эффект на
взаимодействие РНКП с промоторной ДНК
Мутации консервативного района Cß-субъединицы E.coli
Определение границ промоторного комплекса РНКП с мутацией DRV.... 71 Изучение чувствительности промоторного комплекса РНКП DRV к низкой
температуре
Изучение свойств промоторного комплекса РНКП с точечной мутацией

Структурный контекст мутаций промоторного комплекса и предполагаемый
механизм их воздействия на ДНК-белковые взаимодействия
Структура и функции НКД ß'-субъединицы РНКП E.coli
Мутации и делеции НКД ß'-субъединицы E.coli
Получение кристаллов НКД ß'-субъединицы E.coli
Сбор данных рассеяния
Построение трехмерной модели структуры НКД
Общая архитектура молекулы НКД ß ‘-субъединицы РНКП E.coli
Построение модели элоигационного комплекса с учетом структуры НКД ß
‘-субъединицы
Выводы
Список работ, опубликованных автором по теме диссертации
Список цитируемой литературы

Список используемых сокращений
ГСБ - Гибридный сэндвич-беррел ДНК
НКД - Неконсервативнй домен
РНКП - ДНК-зависимая РНК-полимераза
ПААГ — полиакриламидный гель
ПЦР - полимеразная цепная реакция
ЭЯ - элементарная ячейка
ЕБТА - этилендиаминтетраацетат
1РТО - изопропил-р-тио-Б-галактопиранозид
ЫТР - рибонуклеозидтрифосфат
РМББ - фенилметилсульфонилфторид
ЫТСВА - 2-нитро 5-тио-цианобензойная кислота
Х-ва1 — Бромо-хлоро-индолил Ь-Б-галактопиранозид
БББ - додецилсульфат натрия

М). Оба геля содержали SDS в концентрации 0,1%. Электродный буфер содержал 0,025 М Трис-НС1, pH 8,3, 0,192 М глицин и 0,1% SDS. Буфер для нанесения образцов содержал 0,125 М Трис-НС1, pH 6,8, 10% глицерин, 2% SDS, 2 мМ ß-меркалтоэтанол и краситель бромфеноловый синий. Электрофорез проводили при силе тока 15-30 мА. После завершения разделения белковых фрагментов гели переносили на листы бумаги (Whatman) и высушивали в вакууме на инструменте компании Hoefer. Визуализацию радиоактивных фрагментов осуществляли на приборе Storm Phosphorimager от компании GeHealthcare.
Клонирование и очистка белков
Очистка и выделение РНКП
В данной работе использовали 3 разных фермента РНКП, выделенных из клеток E.colï, Taq, и B.sublil. Очистку и выделение РНКП из E.coli или Taq. проводили согласно методике, описанной у Burgess and Jendrissak (1975) с модификациями (Borukhov and Goldfarb, 1993). Все процедуры по очистке РНКП проводились при температуре 4°С. Клеточный осадок (E.coli) или замороженные клетки (Taq) суспендировали в 100 мл лизисного буфера (50 мМ Трис-НС1, pH 7.9, 233 мМ NaCl, 2 мМ EDTA, 1мМ ß-мсркаптоэтанол, 0.1 мМ PMSF, 5% глицерин), содержащего 0.13 мг/мл лизоцима. После инкубации при 0 °С в течение 20-ти минут, к суспензии добавляли дезоксихолат натрия до
0.05%. Смесь инкубировали еще 20 минут и проводили разрушение клеток при помощи ультразвука или в гомогенизаторе высокого давления. Клеточный лизат «просветляли» высокоскоростным центрифугированием в течение 30 минут.
Для осаждения комплекса ДНК с РНКП, к супернатанту добавляли
Polimin Р до концентрации 0.35%. Полученную суспензию инкубировали