Методы анализа процессинга и деградации мРНК с помощью флуоресцентных белков

• Автор: Переверзев, Антон Петрович
• Шифр специальности: 03.01.03
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2015
• Место защиты: Москва
• Количество страниц: 103 с. : ил.

ОГЛАВЛЕНИЕ
ОГЛАВЛЕНИЕ
ВВЕДЕНИЕ
ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ
1.1 Процессинг и деградация мРНК в клетках млекопитающих
1.1.1 Альтернативный сплайсинг
1.1.2 Нонсенс-зависимая деградация мРНК
1.2 Функциональная организация процесса NMD
1.2.1 Участвующие в процессе NMD белки
1.2.2 Механизм распознавания стоп-кодонов как ПСК
1.2.3 Регуляция активности NMD
1.3 Физиологическое значение процесса NMD, а также отдельных факторов NMD в норме и патологии
1.3.1 Регуляция представленности мРНК ееленопротеииов
1.3.2 NMD и ответ клеток на стресс
1.3.3 Регуляция представленности транскриптов, возникающих путем альтернативного сплайсинга
1.3.4 NMD и перестройки генов антител
1.3.5 Участие отдельных факторов NMD в различных процессах физиологии клетки
1.3.6 NMD и фенотипическое проявление генетических заболеваний
1.4 Существующие подходы для исследования процессинга и деградации мРНК
1.4.1 Основные методы, применяемые для исследования процесса сплайсинга
1.4.2 Основные методы, применяемые для исследования процесса NMD
ЦЕЛИ И ЗАДАЧИ
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
2.1 Материалы
2.1.1 Вектора
2.1.2 Реактивы и расходные материалы для клонирования
2.1.3 Оборудование и программное обеспечение для клонирования
2.1.4 Эукариотические клеточные линии, культуральные среды и расходные материалы
2.1.5 Оборудование для работы с клеточными линиями и анализа флуоресцентных сигналов
2.1.6 Реагенты и оборудование для Вестерн-блоттинга
2.1.7 Реагенты и оборудование для выделения РНК, синтеза кДНК и количественной ПЦР
2.2 Методы
2.2.1 Получение генетических конструкций
2.2.2 Культивирование и трансфекция клеточных линий НЕК и HeLa
2.2.3 Культивирование и трансфекция первичных клеток MEF и ES
2.2.4 Флуоресцентная микроскопия
2.2.5 Проточная цитометрия
2.2.6 Вестерн-блоттинг
2.2.7 Нокаут эндогенного UPF1 с помощью кшРНК в культуре клеток
2.2.8 Выделение РНК, получение кДНК и количественная ОТ-ПЦР в реальном времени
2.2.9 Обработка клеточных линий известными ингибиторами NMD и оценка стабильности РНК сенсора
2.2.10 Работа с трансгенными эмбрионами Xenopus laevis
РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ
3.1 Использование пары флуоресцентных белков TagGFP2 и Katushka для мониторинга процессинга РНК in vivo
3.2 Разработка генетически кодируемых репортеров активности NMD
3.2.1 Разработка генетически кодируемого репортера активности опосредуемого сплайсингом NMD
3.2.2 Разработка генетически кодируемого репортера активности независимого от сплайсинга NMD
3.3 NMD в культуре клеток
3.3.1 Выбор контрольной репортерной конструкции для зависимого от сплайсинга NMD.
3.3.2 Тестирование репортера для зависимого от сплайсинга NMD в линии клеток млекопитающих
3.3.3 Оценка способности разработанного репортера зависимого от сплайсинга NMD отслеживать изменения активности NMD в клетках НЕК293Т
3.3.4 Применение разработанного репортера для измерения активности зависимого от сплайсинга NMD в различных линиях клеток
3.3.5 Тестирование репортера для независимого от сплайсинга NMD в линии клеток млекопитающих
3.4 Оценка возможности применения разработанного репортера активности опосредуемого сплайсингом NMD в трансгенных животных на примере эмбрионов шпорцевых лягушек Xenopus laevis
3.5 Применение интрона 2 гена р-глобина человека для усиления экспрессии химерных генов.
ВЫВОДЫ
ЗАКЛЮЧЕНИЕ
СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ
ВВЕДЕНИЕ
Практически каждый этап метаболизма мРНК подвержен специфической регуляции, что обеспечивает сложный пост-транскрипционный контроль экспрессии эукариотических генов. Для установления полной картины регуляции экспрессии транскриптов необходимо исследовать механизмы, регулирующие все этапы метаболизма мРНК от ее синтеза и сплайсинга до транспорта из ядра и деградации в цитоплазме. Одними из самых важных аспектов метаболизма мРНК являются ее сплайсинг и деградация.
Механизмы процессинга и деградации мРНК играют важную роль в усложнении и регулировании траснкриптома и поэтому сами подвержены сложному механизму регулирования. Паттерны альтернативного сплайсинга и активность NMD регулируются в зависимости от типа клеток, их функционального состояния и экзогенных стимулов. Функционируя вместе, альтернативный сплайсинг и нонсенс-зависимая деградация мРНК через механизм RUST опосредуют регуляцию ряда семейств белков, вовлеченных в процессинг мРНК.
Альтернативный сплайсинг играет главную роль в увеличении сложности протеома и регулирует экспрессию генов. Регуляция альтернативного сплайсинга является сложным процессом, который до сих пор до конца не изучен. Было показано, что в регуляции альтернативного сплайсинга участвуют короткие цис-действующие последовательности, но в этот процесс также могут быть вовлечены другие структурные особенности транскриптов, такие как вторичные структуры РНК.
Нонсенс-зависимая деградация (NMD) мРНК является консервативным механизмом разрушения транскриптов с преждевременными стоп-кодонами. NMD устраняет аберрантные мРНК, являющиеся результатами мутаций, альтернативного сплайсинга или перестроек ДНК в иммунных клетках. Главной функцией NMD является недопущение синтеза укороченных с С-конца, потенциально токсичных для клеток белков. Кроме того, как было недавно показано, мишенями этого процесса являются нормальные эндогенные транскрипты, которые несут стоп-кодоны, которые распознаются как преждевременные.
Недавние исследования показали, активность NMD регулируется под действием различных механизмов, включая специфические микроРНК и концентрацию кальция. Таким образом. NMD функционирует как механизм регуляции экспрессии множества

ЦЕЛИ И ЗАДАЧИ
Целью данной работы было создание генетически кодируемых инструментов для исследования процессов процессинга и деградации мРНК на уровне отдельных клеток с помощью флуоресцентных белков.
Для выполнения данной цели были сформулированы следующие задачи:
1. Оценить возможность использования пары флуоресцентных белков TagGFP2 и Katushka для создания генетических репортерных конструкций для мониторинга процессинга РНК in vivo.
2. Сконструировать различные варианты репортерных конструкций для оценки активности процесса NMD в клетках млекопитающих in vivo
3. Протестировать полученные конструкции на возможность отслеживания изменения активности N1 D с помощью известных ингибиторов процесса.
4. Оценить активность NMD в различных линиях клеток и первичных культурах клеток в различных условиях с помощью созданных репортерных конструкций.
5. Оценить возможность применения созданных репортерных конструкций для отслеживания активности NMD в динамике в эмбрионах шпорцевых лягушек Xenopus laevi s.