Анализ клеточного цикла и апоптотической гибели в E1Aad5 иммортализованных и трансформированных фибробластах крысы после действия повреждающих агентов

• Автор: Кураш, Юлия Константиновна
• Шифр специальности: 03.00.25
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2000
• Место защиты: Санкт-Петербург
• Количество страниц: 173 с.

ОГЛАВЛЕНИЕ
ВВЕДЕНИЕ
Цели и задачи исследования
Научная новизна работы
Теоретическое и практическое значение работы
Апробация работы
Глава 1. Литературный обзор
1Л. Функции Е1Аас15 района в процессе иммортализации и трансформации первичных клеток грызунов
1.2. Роль El А в активации программы апоптотической гибели
1.3. Роль El В 19 кДа в супрессии El А-индуцированного апоптоза и трансформации
1.4. Роль Ras онкогена в супрессии апоптотической гибели
1.5. Роль тумор-супрессорных белков р53 и pRb в трансформации клеток
1.6. Роль р53 в осуществлении блоков G1/S и G2/M
1.7. Роль р53 в реализации программы апоптотической гибели
1.8. Регуляция транскрипционной активности р53 тумор-супрессорными белками семейства ARF
1.9. Кооперация онкогенов необходима для трансформации
первичных эмбриональных фибробластов грызунов
Глава 2. Материалы и методы
2.1.Метод получения иммортализованных и трансформированных линий из эмбриональных фибробластов крысы
2.2.Метод культивирования клеток
2.3. Оценка антипролиферативного действия р53 дикого типа и Waf-1 в трансформантах ElA+cHa-ras
2.4. Получение последовательных реклонов

2.5. Гамма—облучение клеток и облучение клеток УФ
2.6. Метод проточной цитофлуориметрии и двух-параметрической проточной цитофлуориметрии с использованием BrdU
2.7. Метод выделения внехромосомной ДНК
2.8. Электрофоретическое исследование внехромосомной ДНК
2.9. Метод приготовления частичного гидролизата ядер REF с помощью микрококковой нуклеазы
2.10. Методы количественной оценки апоптотической гибели
2.11. Исследование состояния белка р53 методом иммунопреципитации
2.12. Исследование связывания белков семейства Rb с онкобелками El А в трансформантах ElA+cHa-ras после действия ДНК-повреждающих агентов методом иммунопреципитации
2.13. Иммунофлуоресценция
Глава 3. Результаты
3.1 .Анализ структуры клеточного цикла и апоптотической гибели в нормальных и El А-иммортализованных фибробластов крысы после
действия ДНК-повреждающих агентов
ЗЛЛ.Анализ статуса белка р53 в REF и El А-иммортализованных клетках
3.1.2. Цитофлуориметрический анализ распределения клеток по фазам клеточного цикла в популяции REF и Е1А-иммортализованных клеток после действия ДНК-повреждающих агентов
3.1.3. Электрофоретический анализ апоптотической гибели в REF и El А-иммортализованных клетках после действия ДНК-повреждающих агентов
3.1.4. Количественная оценка гибели El А-иммортализованных клеток после действия у-облучения, облучения УФ и

культивирования на среде с низким содержанием ростовых факторов сыворотки
3.1.5. Отсутствие G1/S блока в Е1А(128+138)-иммортализованных клетках после действия ДНК-повреждающих агентов не зависит от статуса белка р53
3.1.6. Е1А-индуцированный апоптоз в клетках E1A(12S+13S) не
зависит от статуса белка р53
3.2. Анализ структуры клеточного цикла и апоптотической гибели в транформированных клеточных линиях Е1А+Е1В(19 кДа) после действия ДНК-повреждающих агентов
3.2.1. Комплементация El А с продуктом гена El В (19 кДа) супрессирует Е1А-опосредованный апоптоз
3.2.2. Анализ статуса белка р53 в трансформантах Е1А+Е1В(р19) и Е1А+Е1В(р21)
3.2.3. Анализ структуры клеточного цикла в трансформированных клеточных линиях Е1А+Е1В(р21) и Е1А+Е1В(р19) после действия ДНК-повреждающих агентов
3.2.4. Продукт гена Е1В(19 кДа) супрессирует апоптотическую гибель трансформированных клеток после у-облучения и
культивирования на бессывороточной среде
3.3. Анализ структуры клеточного цикла и апоптотической гибели в транформированных клеточных линиях ElA+cHa-ras после действия ДНК-повреждающих агентов
3.3.1. Кооперация Е1А с онкогеном cHa-ras не подавляет апоптоз, характерный для Е1А-иммортализованных клеток
3.3.2. Спонтанный апоптоз, тестируемый по фрагментации внехромосомной ДНК в ElA+cHa-ras трансформантах, не зависит от статуса белка р53

приводит к увеличению ДНК-связывающей активности р53 (Gu & Roe-der. 1997). С другой стороны, пост-трансляционные изменения в белках, которые взаимодействуют с р53, также могут сказываться на их способности взаимодействовать с р53. Так, фосфорилирование продукта протоонкогена md.m2 протеинкиназой DNA-PK ингибирует способность Mdm2 связываться с р53 (Mayo et al., 1997.).
1.6. Роль р53 в осуществлении блоков G1/S и G2/M.
Одна из основных функций тумор-супрессорного белка р53 связана с его участием в остановке клеток в G1 и G2 фазах клеточного цикла после действия ДНК-повреждающих агентов. Так, гамма-облучение индуцирует р53-зависимую остановку в G1/S фазе клеточного цикла в пролиферирующих фибробластах, тогда как эмбриональные фибробласты генотипа р53-/- теряют способность останавливаться в G1/S, однако задержка в G2/M выражена отчетливо (Kastan et al., 1992.).
Было показано, что после действия у-облучения и облучения УФ происходит фосфорилирование белка р53 по серину 15, а также увеличивается период полураспада р53 и уровень трансляции этого белка с мРНК (Siliciano et al., 1997.). По-видимому, фосфорилирование р53 киназами после повреждения ДНК приводит, с одной стороны, к увеличению времени полураспада р53 и к индукции его транскрипционной активности, а с другой стороны, к ослаблению способности Mdm2 связываться с р53 (Shieh et al., 1997.), то есть к ингибированию убиквитин-зависимого протеолиза белка р53. Однако после действия у-облучения происходит быстрое накопление белка р53, тогда как после облучения УФ аккомуляция р53 наблюдается только через 12 часов после повреж-