Влияние факторов криоконсервации на гидратацию глобулярных белков

• Автор: Марковский, Александр Леонидович
• Шифр специальности: 03.00.22
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 1984
• Место защиты: Харьков
• Количество страниц: 140 c. : ил

ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ
1. Характеристика сил, действующих на биосистемы
при криоконсервации
2. Критерии выбора защитных веществ-криопротекторов
3. Молекулярные аспекты крпопротекции биосистем . . 29 РЕЗУЛЬТАТЫ СОБСТВЕННЫХ ИССЛЕДОВАНИЙ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ
4. Материалы и методы
5. Влияние концентрации и молекулярной массы на диэлектрические и гпдратацпонные свойства растворов криопротекторов
6. Влияние криопротекторов на структурное состояние сывороточного альбутлша и иммуноглобулинов
7. Влияние факторов криоконсервации на структуру и свойства нативных иммуноглобулинов
Заключение
Выводы
Внедрение результатов исследований в практику
Список литературы
Список сокращении
ПРИДШЕНИЕ
1. Определение диэлектрических констант £ и £," резонаторным методом
2. Предельные ошибки измерения £ и V • • •
3. Определение гидратации белков на основе диэлектрической проницаемости матричных систем
4. Определение размеров агрегатов белков по данным светорассеяния

В настоящее время уровень молекулярных ОСНОВ 1фПО-бпологпп - науки, пзучащей проблемы сохраненпя жизнеспособных бпосистем под действием низких температур, - еще недостаточен для объяснения совокупности процессов, приводящих как к повреждениям, так п крпозащпте, п требует более детального анализа с позиций фпзпко-хш.тической бполо-гпп.
Успехи в области хранения биообъектов при температуре -196°С позволили по-новому подойти к вопросу о роли воды в живых системах п предложить методы повышения выживаемости /1,219/. Общепринято /8,61/, что выживание крпокон-сервированных биообъектов обычно зависит от двух факторов: температурного - возможности контролировать скорости замораживания - отогрева п от специфической обработки биообъектов, по крайней мере, одним химическим агентом - крпопро-тектором.
Традиционный подход к вопросу крпоконсервацип биообъектов - снижение повреждающего действия кристаллов льда п обусловленный этим фактором выбор антифризов и скоростей замораживания - отогреЕа /179,30/ - в настоящее время претерпевает значительный поворот в сторону количественных физико-химических параметров, характеризующих процессы крпоконсервацпп. Основная заслуга в этом направлении принадлежит крпобнохпмпп - пауки, пзучащей влияние нпзкпх температур на реакционную способность бпосистем при условии компенсации фпзпко-химпческпх параметров среды к их значениям в нормальных условиях /24/. Исследования в этом
направлении дают криобиологии очень важную информацию о прямом действии низкой температуры на кинетические параметры ферментативных процессов в биоспстемах /47,73/.
Существующая на сегодняшний день практика крпокон-сервацпп биообъектов базируется не на точных количественных фпзпко-хиглпчесішх параметрах среды консервации как до, так и после охлаждения - отогрева, а на эмпирически подобранных концентрациях крпопротекторов п скоростей замораживания - отогрева.
Б общих чертах, физико-химический анализ процессов, происходящих при крпокопсервацпп должен включать: а) явления, обусловленные взаимодействием бпоспстемн с водным раствором криопротектора, в общем плане это касается поведения бпоструктур в смешанном растворителе; б) поведение бпосистем, обусловленное снижением температуры до образования льда; в) механо-фпзпческпе эффекты, обусловленные кристаллообразованием среды.
Как показывает анализ литературных данных, большинство авторов /94,88,185/, обсуждая возможные механизмы криозащпты п крпоповрежденпя биоструктур различного уровня организации, не рассматривают походное состояние этпх структур перед охлаждением, обусловленное контактами со средой с измененными параметрами. К таким параметрам среды, имеющим первостепенное значение в поддержании структурной целостности п функциональной активности бпосистем, следует отнести: диэлектрическую проницаемость среды, дифильность молекул крпопротекторов (паличне гидрофобных и гидрофильных групп), растворимость молекул крпопротекторов, соотношение свободной п связанной воды в крпопротектпрущей сре-

Для водных растворов крпопротекторов - глицерина, сахарозы и полиэтиленгликоля, изменение диэлектрической проницаемости при увеличении концентрации имеет нелинейный характер, т.е. аддитивная функция смещения для определения диэлектрической проницаемости смесей, ш.тещая вид /102/:
мл)=г((£;)+«-т(&)
(где - объемная доля крпопротектора), не выполняется.
При концентрации крпопротекторов в растворе 15$ вес. снижение диэлектрической проницаемости для глицерина составляет - 22$, для сахарозы - 16$ и для ПЭГ - 400 - 24$ соответственно.
Представленная на рис. 6 зависимость диэлектрической проницаемости водного раствора лоллвиншширролпдона (ПВП) от концентрации отличается от всех ранее представленных. Снижение диэлектрической проницаемости при значении концентрации 2,5$ вес. составляет 22$ и далее с увеличением концентрации крпопротектора в растворе не изменяется.
Физические принципы интерпретации релаксационных процессов в микроволновой области дисперсии диэлектрической проницаемости основываются на том, что в этом диапазоне ре-лакспрует часть молекул свободной воды. Поэтому любое изменение диэлектрической проницаемости должно отражать изменение находящейся в исследуемой системе свободной воды. В работах /71,208/ было показано, что в диэлектрической релаксации принимают участие только молекулы с одной Н-связыо. В этом плане уменшенке диэлектрической проницаемости свидетельствует О снижении ДОЛИ молекул ВОДЫ С ОДII011 водородной связью, т.е. с большей упорядоченностью структуры свободной