Структурно-функциональная характеристика гена рокристаллина лягушки Rana temporaria

• Автор: Микаелян, Арсен Суренович
• Шифр специальности: 03.00.15
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 1998
• Место защиты: Москва
• Количество страниц: 117 с. : ил.

1 ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ
1.1 КРИСТАЛЛИНЫ: ПРИМЕР ИСПОЛЬЗОВАНИЕ ПРЕДСУЩЕСТВУЮЩИХ БЕЛКОВ ДЛЯ ВЫПОЛНЕНИЯ НОВЫХ ФУНКЦИЙ
1.2 КАНОНИЧЕСКИЕ КРИСТАЛЛИНЫ, ИХ РОДСТВО СО СТРЕСС-ИНДУЦИРУЕМЫМИ БЕЛКАМИ
1.2.1 а-кристаллины: стресс-индуцируемые белки и шапероны
1.2.2 /А и у-кристаллины: белки осмотического шока
1.3 ТАКСОН-СПЕЦИФИЧЕСКИЕ ФЕРМЕНТЫ-КРИСТАЛЛИНЫ
1.3.1 е-кристатин I лактатдегидрогенеаза
1.3.2 5-кристаллиныаргитнсукцинатлиазы
1.3.3 т-кристаллин а-энолаза и г]-кристаллиналъдегиддегидрогеназа
1.3.4 р-кристаллин. I алъдо-кеторедуктазы
1.3.5 р-кристаллинI орнитинциклодеаминаза и Я-кристаллин гидроксиацил-СоА-дегидрогеназа
1.3.6 £-кристаллиналкоголъдегидрогеназа
1.4 КРИСТАЛЛИНЫ БЕСПОЗВОНОЧНЫХ
1.5 Экспрессия кристаллиновых генов
2 МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
2.1 Объект исследования
2.2 Выделение тотальной РНК
2.2.1 Выделение тотальной РНК горячим фенольным методом с использованием гуанидинизотиоцианата
2.3 Получение poly(А)+-РНК
2.4 Получение кДНК банка
2.4.1 Синтез первой цепи кДНК
2.4.2 Синтез второй цепи кДНК
2.4.3 Клонирование кДНК
2.5 Выделение хромосомной ДНК из семеников лягушки
2.6 Получение библиотеки геномной ДНК Rana temporaria
2.6.1 Приготовление хромосомной ДНК для клонирования
2.6.2 Приготовление векторной ДНК
2.6.3 Лигирование
2.6.4 Получение экстрактов для in vitro упаковки
2.6.5 Упаковка in vitro
2.6.6 Амплификация библиотеки
2.6.7 Выделение рекомбинантной фаговой ДНК из фаговых бляшек
2.7 Выделение плазмидной ДНК
2.8 Трансформация клеток E
2.9 Рестрикция ДНК
2.10 Электрофорез ДНК в ПААГ и агарозных гелях
2.11 Элюция ДНК из ПААГ
2.12 Элюция ДНК из агарозного геля
2.13 Элюция ДНК из легкоплавкой агарозы
2.14 Мечение препаратов ДНК
2.14.1 Ник-трансляция препаратов ДНК
2.14.2 Мечение фрагментов ДНК методом полимеразного копирования с использованием мультипраймеров
2.15 Дот- гибридизация РНК
2.16 Блот- гибридизация
2.17 Перенос клеточных колоний и фаговых бляшек с чашек Петри на нитроцеллюлозные фильтры
2.18 Определение нуклеотидной последовательности ДНК
2.18.1 Метод полимеразного копирования с использованием фрагмента Кленова ДНК-полимеразы 1 и ддНТФ в качестве терминирующих аналогов (Sanger, 1977)
2.19 Определение первичной структуры ДНК методом терминации цепей с использованием фермента “sequenase”
2.19.1 Секвенирующие (структурные) полиакриламидные гели
2.20 Компьютерный анализ первичных структур
3 РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ
3.1 Введение
3.2 ТКАНЕСПЕЦИФИЧЕСКАЯ ЭКСПРЕССИЯ р-КРИСТАЛЛИНА
3.3 Получение полноразмерной кДНК р-кристаллина хрусталика глаза лягушки Rana temporaria
3.3.1 Получение и скрининг библиотеки кДНК из хрусталика глаза лягушки Rana temporaria
3.4 Получение и скрининг геномного банка травяной лягушки Rana temporaria
3.4.1 Получение банка хромосомной ДНК лягушки R. temporaria
3.4.2 Скрининг геномного банка. :
3.5 Анализ клонов и построение рестрикционных карт
3.6 Экзон-Интронная структура ДНК геномных клонов
3.7 Идентификация промоторного участка гена р-кристаллина лягушки Rana temporaria

экстрагировали несколько раз фенол-хлороформом и хлороформом. РНК осаждали двумя объемами этанола. Хранили РНК в 70% этаноле, при -20°С.
2.3 ПОЛУЧЕНИЕ РОЬУ(А)+-РНК.
Колонку объемом 1 мл заполняли oligo(dT) целлюлозой, уравновешенной стерильным буфером для нанесения РНК (Aviv, Leder, 1972), и промывали ее последовательно стерильной водой, 0.1 м NaOH, 5 мМ ЭДТА и снова стерильной водой. Значение pH на выходе колонки контролировали: оно не должно превышать рН8.0. После этого колонку промывали пятью объемами буфера для нанесения РНК.
Перед нанесением РНК, растворенную в стерильной НзО, прогревали до 65°С, смешивая с равным объемом 2 х буфера для нанесения (40мМ трис-НС1, pH 7.6, IM NaCl, 2мМ ЭДТА, 0.1% SDS) охлаждали до комнатной температуры и наносили на колонку. Колонку промывали 7 объемами буфера для нанесения и четырьмя объемами этого же буфера со сниженной концентрацией NaCl (0.1М). Poly (А)+ -РНК элюировали 3-мя объемами стерильного раствора следующего состава: 10 мМ ТрИС-НС1, рН7.5, 1 мМ ЭДТА, 0.05% SDS.
РНК осаждали 2.2 объемами этанола в присутствии 0.3 М ацетата натрия при -20°С. Осадок промывали 70% спиртом. Хранили РНК в 70% этаноле при -20°С
2.4 ПОЛУЧЕНИЕ кДНК БАНКА.
Для получения кДНК банка использовали -протокол и набор реагентов "cDNA Synthesis System Plus” фирмы Amersham.
2.4.1 Синтез первой цепи кДНК.
Готовили реакционную смесь следующего состава:
5 х буфер для синтеза первой цепи 4 мкл,