Выявление и изучение клеточных функций Escherichia coli, участвующих в генетическом контроле развития бактериофагов

• Автор: Синеокий, Сергей Павлович
• Шифр специальности: 03.00.15
• Научная степень: Докторская
• Год защиты: 1999
• Место защиты: Москва
• Количество страниц: 143 с. : ил.

СОДЕРЖАНИЕ
I. ВВЕДЕНИЕ
II. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ
1. Белки клеточной стенки E.coli, участвующие в фаговой адсорбции и транспорте колицинов
1.1. Пориновые белки
1.2. Белки-рецепторы фагов и колицинов, участвующие в специфическом транспорте
1.3. Транспорт колицинов
1.4. ТопВ иТо1А -зависимые транспортные системы и импорт макромолекул
в E.coli
1.5. Участие белков ЕхЬВ и ExbD в ТопВ зависимом транспорте
1.6. Продукты генов toi и импорт макромолекул в E
1.7. Механизм транспорта макромолекул системой Toi
1.8. Взаимозаменяемость белков ТonB-ExbB-ExbD и То1 А-ТolQ
1.9. Многостадийность фаговой инфекции
2. Элементы системы адаптация клеток Escherichia coli к
воздействиям окружающей среды
2.1. SOS система
2.2. Регуляция синтеза капсульного полисахарида
2.2.1. Основные элементы регуляции синтеза колановой кислот
2.2.2. RcsC и RcsB как пара сенсор - эффектор
2.2.3. Протеаза Lon контролирует уровень RcsA
2.2.4. Стимуляция транскрипции генов cps зависит от взаимодействия RcsA
с RcsB
2.2.5. Модель регуляции синтеза клеточной капсулы
2.3. Переход в стационарную фазу как последняя стадия адаптивного
ответа
2.3.1. RpoS -зависимые гены
2.3.2. RpoS-зависимые гены могут быть элементами других регуляторных систем
2.3.3. Регуляция гена RpoS
2.3.4. Как RpoS контролирует экспрессию генов
III. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
1. Бактериальные штаммы, плазмиды и бактериофаги
2. Питательные среды и реактивы
3. Перенос мутации из плазмиды в хромосому
4. Генетические методы конструирования штаммов
5. Проверка утилизации витамина В12
6. Методы работы с ДНК
7. Фракционирование компонентов оболочки клеток
8. Анализ клеточных белков
9. Анализ адсорбции фага С1
10. Комплементационный анализ мутантов по фаговой адсорбции
11. Качественное и количественное определение эффективности
индукции профага ля

12. Спот-тест и количественное определение эффективности индукции
профага X
13. Определение эффективности адсорбции фага лямбда
IV. РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ
1. Изучение клеточного генетического контроля адсорбции
бактериофага С1
1.1. Выделение бактериофага С1 и получение мутантов E. coli, дефектных
по адсорбции фага С1
1.2. Клонирование генов йсгА и dcrB
1.3. Локализация генов der А и dcrB внутри клонированных фрагментов
ДНК и на физической карте E.coli
1.4. Анализ нуклеотидной последовательности генов der А и derb
1.5. Оперонная организация экспрессии гена dcrB
1.6. Идентификация продукта гена dcrB
1.7. Локализация белка DcrB в мембранных фракциях
1.8. Продукт гена dcrA не влияет на экспрессию dcrB
1.9. Утилизация витамина Вц в мутантах dcrB и dcrA
1.10. Плейотропные эффекты, вызванные инактивацией или увеличением
дозы гена dcrA в клетке
1.11. Построение модели адсорбции бактериофага С1
1.12. Изучение участков бактериальной хромосомы на 63.1 и 77.8 минутах карты E.coli, прилегающих к генам dcrA и dcrB
2. Изучение SOS-незавигчмых клеточных функций, контролирующих
индукцию лямбдоидных фагов
2.1. Клонирование генов Escherichia coli, сверхэкспрессия которых
приводит к RecA- независимой индукции профага лямбда
2.2. Избыток RcsA и DsrA в клетке приводит к RecA-независимой
индукции профага лямбда
2.3. Влияние сверхпродукции RcsA и DsrA на индукцию других
лямбдоидных фагов
2.4. Количественное определение эффективности RecA-независимой
индукции профага лямбда
2.5. Роль генов rcsA,rcsB и dsrA в RecA-независимой индукции профага
лямбда
2.6. Эффективность RcsABC пути индукции профага лямбда при
сверхпродукции cI-А. репрессора
2.7. Индукция профагов - естестенный ответ клетки на различные
стрессовые воздействия
V. ОСНОВНЫЕ РЕЗУЛЬТАТЫ И ВЫВОДЫ
VI. ЛИТЕРАТУРА

I. ВВЕДЕНИЕ
На современном этапе развития бактериальной генетики выявление и изучение новых генетических функций E.coli остается одной из наиболее важных и интересных задач. По мере увеличения количества известных генов, данных об их роли в различных процессах, регуляции, вовлеченности в глобальные клеточные регуляторные сети - получение информации о каждом новом гене и новых функциях ранее обнаруженных генов представляет все более общий интерес, поскольку может рассматриваться во взаимосвязи с ранее накопленными сведениями. Определение первичной последовательности ДНК E.coli и рамок считывания, которые потенциально могут являться новыми бактериальными генами, дало новый импульс в этих исследованиях. Появилась возможность организации масштабных проектов направленного введения мутаций в потенциально новые гены с последующим анализом различных фенотипических изменений. В то же время, разработка новых методов направленного отбора мутантов, проявляющихся в различных фенотипических изменениях, по-прежднему, необходима для выявления генетического контроля многих клеточных функций.
Одним из общих подходов генетического изучения E.coli является выявление клеточных генов, влияющих на различные этапы развития бактериофагов. Эффективность этого подхода связана с тем, что развитие бактериофагов зависит от многих бактериальных генов, участвующих также в контроле различных клеточных процессов. Мутации в подобных генах, как правило, приводят к нарушению развития бактериофага, что и является, обычно, их наиболее легко тестирумым фенотипическим проявлением. Наибольшее количество работ, использующих этот подход для генетического изучения E.coli, посвящено выявлению генов необходимых для различных существенных этапов развития бактериофага лямбда.(11. Hendrix 1983). Эти работы позволили выявить десятки ранее неизвестных бактериальных генов

имеют максимальную экспрессию генов cps, когда содержат дикую аллель гена res А, но продолжают синтезировать значительные количества клеточной капсулы, если ген rcsA инактивирован мутацией (Brill et al., 1988; Gottesman and Stout, 1991).
2.2.4. Стимуляции транскрипции генов cps зависит от взаимодействия белков RcsA и RcsB.
Вывод о взаимодействии RcsA с RcsB был сделан, исходя из ряда экспериментальных данных. Во-первых, RcsB влияет на стабильность RcsA in vivo (Stout et al., 1991). Период полураспада RcsA, синтезируемого с многокопийной плазмиды, увеличивается при избытке RcsB в клетке с 3 до 10 минут и уменьшается до одной минуты при его отсутствии. Во-вторых, укороченный RcsB, синтезируемый с плазмиды, вызывает снижение синтеза капсульного полисахарида в клетках, содержащих мутацию в гене Ion. Предположено, что укороченный RcsB образует смешанные нефункциональные мультимеры с регуляторным элементом, важным для активации синтеза клеточной капсулы. Данный негативный эффект устраняется при наличии в клетке избытка RcsA (Brill et al., 1988). Этот факт свидетельствует, что RcsB и RcsA образуют мультимер. Вполне вероятно, что RcsA помогает RcsB выполнять позитивную регуляцию транскрипции генов cps. Это подтверждается наличием в белковых последовательностях RcsA и RcsB С-концевых ДНК-связывающих мотивов (Stout et al., 1991).
2.2.5. Модель регуляции синтеза клеточной капсулы.
Основываясь на анализе системы Rcs-Cps, предположено существование двух альтернативных механизмов активации синтеза клеточной капсулы (Gottesman, 1995; Gottesman and Stout, 1991) (рис.П-З). При первом механизме природные сигналы конвертируют RcsC в активную киназу, которая фосфорилирует RcsB, по аналогии с реакцией фосфорилирования, отмеченной для других пар сенсор-эффектор. Фосфорилированый RcsB даже при отсутствии RcsA стимулирует синтез клеточной