Изучение генетического контроля и молекулярных механизмов устойчивости к индуктору окислительного стресса менадиону у цианобактерии Synechocystis sp. штамм РСС 6803

• Автор: Семина, Мария Евгеньевна
• Шифр специальности: 03.00.15
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2007
• Место защиты: Москва
• Количество страниц: 94 с. : ил.

ОГЛАВЛЕНИЕ

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

ВВЕДЕНИЕ.

ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.

1. Механизмы действия ингибиторов хинонного типа.

1.1. Ингибирование электронного транспорта

2. Механизмы защиты от ингибирующего действия хинонов.

2.1. Антиоксидантные системы

2.2. Восстановление хинонов с участием ИАБРНхиноноксидоредуктаз

3. Электронтранспортная цепьтилакоидной мембраны цианобактерий.

3.1. Фотосинтетическая ЭТЦ

3.2. Дыхательная ЭТЦ
3.2.1. Доноры электронов для дыхательной ЭТЦ
3.2.2. ЫАОРНдегидрогеназы
3.2.2.1. дегидрогеназа типа 1 1
3.2.2.2. дегидрогеназа типа 2
3.3. Сукцинатдегидрогеназа
3.4.Комплекс цитохромов 6
3.5. Цитохромоксидазы дыхательной цепи
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
Штаммы и плазмиды.
Условия роста.
Трансформация ii i
Трансформация i
Выделение плазмидной ДНК методом кипячения , i,
Выделение хромосомной ДНК из клеток цианобактерий.
Ферментативная обработка ДНК
Электрофорез в агарозном геле.
Элюирование ДНК из агарозного геля.
Полимеразная цепная реакция
Измерение МТТредуктазной активности.
Выделение тилакоидных мембран из клеток i .
Измерение ферментативной активности
ЭПР спектроскопия
блоттгибридизация
ОТПЦР.
Компьютерная обработка данных
РЕЗУЛЬТАТЫ.
Дегидрогеназная активность в клетках дикого типа и мутантов
Анализ устойчивости к менадиону клеток дикого типа и мутантов
Конструирование двойных мутантов.
Конструирование рекомбинантной плазмиды
Конструирование рекомбинантной плазмиды 4

Трансформация клеток мутантов 1, , 2 и Ох.
Проверка сегрегации мутаций
Физиологические характеристики двойных мутантов
Анализ устойчивости к менадиону
Ферментативная активность в бесклеточных препаратах дикого типа и
мутанта .
Восстановление Р0 в клетках дикого типа и мутантов
Экспрессия гена .
Изучение функции гена с помощью очищенного белка i.
ОБСУЖДЕНИЕ.
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ


Конструирование двойных мутантов. Трансформация клеток мутантов 1, , 2 и Ох. . Экспрессия гена . Изучение функции гена с помощью очищенного белка i. ОБСУЖДЕНИЕ. АТФ АТР аденозинтрифосфат ДНК дезоксирибонуклеиновая кислота. Т.п. , спектиномицин, устойчивость к снектиномицину, соответственно i i . Хиноны, такие как менадион 2метил1,4нафтохинон и плумбагин 5гидрокси2метил1,4нафтохинон, индуцируют окислительный стресс в клетках аэробных организмов. Ингибирующее действие хинонов обусловлено одноэлектронным восстановлением до семихинонов. Семихинон может взаимодействовать с молекулярным кислородом с регенерацией исходного хинона и образованием супероксида, который индуцирует окислительный стресс , ivi, . При восстановлении хинонов по двухэлектронному механизму образуется нетоксичный гидрохинон i . У фотосинтезирующих организмов менадион может влиять на транспорт электронов, как в фотосинтетической, так и в дыхательной электронтранспортной цепи далее ЭТЦ. Липофильные хиноны с низкими окислительновосстановительными потенциалами, такие как менадион и плумбагин, легко проникают в тилакоидные мембраны цианобактерий и хлоропластов растений, где они могут акцептировать электроны из фотосинтетической цепи на уровне разных компонентов. У цианобактерии i . РСС далее i , дыхательная и фотосинтетическая системы транспорта электронов совмещены в тилакоидной мембране. Общими переносчиками, являются пул пластохинона , комплекс цитохромов и пластоцианин. Главными компонентами дыхательной ЭТЦ являются дегидрогеназный комплекс 1, окисляющий преимущественно и восстанавливающий пул , и цитохромоксидаза, которая восстанавливает кислород до воды. В восстановлении пула пластохинона также принимают участие дегидрогеназный комплекс 2, окисляющий i . , окисляющая сукцинат и функционирующая главным образом в темноте , V, . Фотосинтетическая ЭТЦ содержит два типа реакционных центров фотосистему I ФС1 и фотосистему II ФСИ. ФСН, пул , комплекс ЦИТОХрОМОВ ФС1 приводит к восстановлению . В отсутствие активности ФСН в тилакоидной мембране может осуществляться циклический транспорт электронов вокруг ФС1, в котором участвует дегидрогеназный комплекс 1, окисляющий и возвращающий электроны в фотосинтетическую ЭТЦ через и комплекс цитохромов . В основе противодействия клеток окислительному стрессу лежит активация защитных систем, к которым относится ряд ферментов, таких как супероксиддисмутазы, каталазы и пероксидазы. Кроме того, важную роль в защите клеток как прокариотических, так и эукариотических организмов от ингибирующего действия хинонов играют дегидрогеназы, способные осуществлять двухэлектронное восстановление этих агентов с образованием нетоксичных гидрохинонов i . В клетках млекопитающих обнаружен эффективный механизм защиты от токсического действия хинонов. Цитозольный фермент ЫА0РНхиноноксидоредуктаза диафораза восстанавливает хиноны по двухэлектронному механизму, препятствуя их одноэлектронному восстановлению другими ферментами . i . Функциональный гомолог диафоразы КАОРНхиноноксидоредуктаза, кодируемая геном , был обнаружен у цианобактерии i . РСС Чеснавичене и др. . . У нефотосинтезирующих организмов менадион взаимодействует, главным образом, с дыхательной ЭТЦ. У фотосинтезирующих организмов менадион может акцептировать электроны из фотосинтетической ЭТЦ на уровне ферредоксинЫАЭРоксидоредуктазы, ФС1, ФСН и комплекса цитохромов , iv . Роль дегидрогеназ и оксидаз в устойчивости к менадиону клеток фотосинтезирующих организмов оставалась не ясной. Целью данной работы было выяснение роли генов, кодирующих дегидрогеназы и оксидазы, в контроле устойчивости клеток цианобактерии i к индуктору окислительного стресса менадиону.