Роль и распределение остатков цистеина в молекуле альфа-актинина

• Автор: Надирашвили, Нугзар Шотаевич
• Шифр специальности: 03.00.04
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 1984
• Место защиты: Тбилиси
• Количество страниц: 111 c. : ил

I. ЛИТЕРАТУРНЫЙ ОБЗОР
1.1. с<-актшшн и его роль в двигательных
системах
1.2. Физические и химические свойства о£-актинина
1.3. Выделение и физико-химические свойства сХ-актинина из немышечных тканей
1.3.1. Выделение оо-актинина из тромбоцитов ткани
1.3.2. Взаимодействия об-актинина с Ф-актином
1.4. Изучение некоторых свойств ох-актинина
П. ЭКСПЕРИГШТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ
П.1. Материалы
П. 2. Методы исследования
Ш. РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЩЕНИЕ
Ш.1. Выделение и характеристика о4-актинина из
спинных мышц кролика
Ш.2. Классификация остатков цистеина ос-актинина .... 48 Ш.З. БН-группы и биологическая активность -актинина
Ш.4. Ограниченный трипсинолиз о: -актинина и распределение сульфгидрильных груш по фрагментам
молекулы
ВЫВОДЫ
ЛИТЕРАТУРА

Мышечное сокращение представляет собой сложный процесс, в который вовлечены как основные компоненты сократительного аппарата - актин и миозин, так и целый ряд белков, представленных в мышце в минорном количестве - тропомиозин, тропонин, С-белок, оС , /3 , у -актинины и ряд других. Установлено, что минорные белки соединяют толстые и тонкие протофибриллы, регулируют взаимодействие между актином и миозином, создают упорядоченную структуру саркомера и др. Для понимания тонких механизмов сокращения мышц необходимо детальное исследование структурно-функциональных свойств их индивидуальных компонентов. В частности, представляет большой интерес изучение в этом отношении об-актинина, минорного белка, первоначально обнаруженного в скелетных мышцах, а затем найденного во всех мышечных и немышечных двигательных системах, которые были испытаны на его присутствие. Установлено, что об-актинин может осуществлять, по крайней мере, три различные функции в мышце: а) вызывает агрегацию актиновых мономеров и тем самым участвует в регулировании соотношения агрегированного и мономерного актина в клетках; б) служит в качестве присоединяющей пластинки или организующего центра для ^реформированных актиновых филаментов, проявляя специфичность в связывании с актино-выми филаментами; в) модифицирует структуру актиновых мономеров в случае, когда эти мономеры находятся в агрегированном состоянии и эта модификация может повышать эффективность актина в поддержании биологического движения.
К началу экспериментальной работы, результаты которой изложены в диссертации, были изучены некоторые физико-химические свойства оС-актинина, его гидродинамические параметры, локали-

зация в мышце, молекулярная масоа, субъединичная структура и некоторые др. Однако, в литературе не имелось данных о структурной организации сб-актинина, расположении его активных участков, функциональной роли отдельных аминокислотных остатков.
Настоящее исследование является частью работ, проводимых в секторе биофизики Института физиологии им.И.С.Бериташвили АН Грузинской ССР по детальному изучению физико-химических основ мышечного сокращения. Оно посвящено выяснению типа и роли отдельных остатков цистеина и их распределения в молекуле белка. Для химической модификации тиольных групп были использованы р-хлор-меркурибензоат, [14с] -иодацетамид, Г14с] -этилмалеимид.
В результате проведенной работы установлено, что об-актинии содержит остатки цистеина разного типа: экспонированные для модифицирующих реагентов, слабо реагирующие и недоступные или "маскированные" в пространственной структуре белка. Показано, что наличие свободных экспонированных тиольных групп является существенным для проявления белком функциональной активности. Кроме того, исследован ограниченный протеолиз нативного и модифицированного [14с] н-этилмалеимидом об-актинина при действии трипсина, что позволило представить общее строение молекулы и локализовать экспонированные и "маскированные" остатки цистеина во фрагментах ограниченного трипсинолиза. Локализация в структуре ос -актинина остатков цистеина различного типа позволит более детально представить организацию функциональных участков в молекуле.

радируются соседними аминокислотными остатками и стерически недоступны для химических реагентов. Кроме того, эти группы могут образовать внутримолекулярные химические связи ("химическая модификация").
Целью настоящей работы являлось изучение количества, расположения и реакционной способности сульфгидрильных групп мышечного белка о(. -актинина. Количество БН-групп ос-акти-нина кролика определяли двумя реагентами: пара-хлормеркурибен-зоатом (метод Бойера) и 5,5-дитиобис-2-нитробензоатом (метод Эллмана) в различных условиях.
К двум мл раствора белка (I мг/мл) добавляли 10 мкл I мМ раствора парахлормеркурибензоата (ПХМБ). Отсчет на спектрофотометре брали каждые 5 мин до прекращения роста оптической плотности. На кривой титрования приведены значения Е£5д через 25 глин после добавления каждой порции реагента (рис.2, кривая I). Серия опытов показала, что в нативном ос-актинине титруется 5-6 БН-групп. Полученный результат хорошо согласуется с литературными данными /143/. С целью определения так называемых "замаскированных" БН-групп титрование проводили в 0,5-1 % растворе додецилсульфата натрия. Известно, что длительная инкубация ос -актинина с додецилсульфатом натрия (ДОН) приводит к изменению конформации белка и потере биологической активности /12/; кроме того, высвободившиеся "внутренние" бн-группы могут быть окислены кислородом воздуха, и в связи с этим затрудняется определение БН-групп. Принимая во внимание вышесказанное, для определения общего числа БН-групп белка реагент (ПХМБ) в разном количестве и детергент (ДСН) добавляли к одинаковым порциям белка одновременно, и отсчет на спектрофотометре снимали через 1,5,10,20 и 30 мин. Результаты одного