Регуляция Са 2+ активности аденилатциклазы, фосфодиэстеразы и содержания цАМФ в слизистой тонкой кишки кролика при действии холерного энтеротоксина

• Автор: Мелихов, Владимир Иванович
• Шифр специальности: 03.00.04
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 1984
• Место защиты: Киев
• Количество страниц: 140 c. : ил

ГЛАВА I. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ
1. Механизмы функционирования аденилатциклазы
и фосфодиэстеразы
а) Аденилатциклаза, структура и регуляция активности
б) Фосфодиэстераза циклических нуклеотидов, структура и регуляция активности
2. Физиологическая роль внутриклеточного кальция
а) Регуляция содержания свободного внутриклеточного Са^+

б) Регуляция ионами Са активности аденилатциклазы и фосфодиэстеразы
3. Молекулярные механизмы развития синдрома
диареи при холере
а) Роль циклического АМФ в патогенезе холеры
б) Молекулярные механизмы действия холерного энтеротоксина на аденилатциклазу
ГЛАВА 2. МЕТОДЫ И МАТЕРИАЛЫ
ГЛАВА 3. РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ
1. Влияние двухвалентных катионов на активность аденилатциклазы слизистой тонкой кишки кролика
2. Роль фосфодиэстеразы и ионов Са^+ в регуляции содержания внутриклеточного цАМФ в слизистой тонкой кишки кролика
3. Влияние Са^+ на содержание цАМФ в слизистой тонкой кишки кролика и на секрецию жидкости
ГЛАВА 4. ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ

ВЫВОДЫ
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ
СПИСОК ПУБЛИКУЕМЫХ СОКРАЩЕНИЙ

Актуальность проблемы. Циклический аденозин - 3,5' - монофосфат (цАМФ) является посредником действия большинства гормонов и ряда биологически активных веществ на клетки. В настоящее время изучается роль этого циклического нуклеотида в регуляции внутриклеточных биохимических процессов. Особый интерес вызывают работы, посвященные изучению роли цАМФ при различной патологии у животных и человека. Изучается роль циклического нуклеотида в патогенных механизмах развития диареи при ряде кишечных инфекций, в частности, при холере. Актуальность проблемы диктуется рядом соображений. Возможность возникновения эпидемических вспышек холеры не устранена до настоящего времени, а ее лечение до сих пор базируется, в основном, на заместительной терапии, главная задача которой сводится к возмещению массовых потерь воды и электролитов, а не к устранению первичных патогенных механизмов развития диареи. Диарейный синдром является существенным и при других кишечных инфекциях, таких как сальмонеллез и дизентерия. Понимание молекулярных механизмов развития синдрома кишечного обезвоживания при холере позволит найти более эффективные способы предотвращения этого процесса и лечения больных холерой людей.
Работами Кимберга (112, 183), Шарпа (174), Чена и других авторов (57, 58, 78), проведенными на клиническом и экспериментальном материале была обнаружена взаимосвязь диареи при холере с увеличением содержания цАМФ в клетках слизистой тонкой кишки. Было показано, что максимальное проявление диарейного процесса совпадает с максимальным увеличением содержания цАМФ в слизистой тонкой кишки. Холерный энтеротоксин активирует аденилатцик-лазу этой ткани - фермента, синтезирующего цАМФ, и не влияет на активность фосфодиэстеразы - фермента, осуществляющего гидролиз

была линейной в течение 20 мин для мембранного препарата и 15 мин для гомогената (рис.4). Образование цАМФ линейно зависело от количества белка в пробе в области от 25 до 100 мкг (рис.5).
Выход цАМФ после хроматографии на AlgOg определяли с помощью

( Н)-цАМФ. Пробирки с 50 мкл раствора ( Н)-цАМФ обрабатывали таким же образом, как и экспериментальные пробы. Элюат с колонок собирали и доводили его объем до 5 мл. Из этого объема отбирали 0,5 мл и измеряли в нем содержание ( Н)-цАМф. Для этого к исследуемой жидкости (0,5 мл) добавляли 10 мл сцинтиллятора Ready Soiv фирмы Вес Ат ап (США). Радиоактивность этой пробы определяли на сцинтилляционном счетчике. В точно таких же условиях определяли

радиоактивность исходно взятых 50 мкл ( Н)-цАМФ, то есть объем

исходного раствора ( Н)-цАМФ доводили до 5 мл и отбирали на счет 0,5 мл. Выход (%)-цАМФ составлял обычно 50-90% и был постоянным для каждой отдельной фасовки AlgOg.
Измерение активности аденилатциклазы в присутствии холерного энтеротоксина (20 мкг/мл) проводили в присутствии в инкубационной среде фермента дополнительно I мМ НАД+ и I мМ дитиотреитола (71). Преинкубацию мембранного препарата с холерным энтеротоксином проводили в I мл среды следующего состава: 50 мМ трис-НС1 (pH 7,5 при 37°С), 5 мМ 0,25 мМ АТФ, I мМ креатинфосфат натрия, 0,5 мг/мл креатинфосфокиназы, 0,01 мМ ГТФ, I мМ НАД+ и I мМ дитиотреитола, 20 мкг/мл холерного энтеротоксина, 2 мг/мл белка мембранного препарата. Инкубировали 20 мин при 37°С, а затем реакцию останавливали 9 мл холодного 20 мМ трис-HGI буфера (pH 7,4 при 4°С), центрифугировали при 4000 оу 15 мин, надосадоч-ную жидкость отбрасывали, а осадок суспендировали 10 мл того же буфера и вновь центрифугировали при том же режиме. Конечный осадок ресуспендировали в 400 мкл 20 мМ трис-HGI буфера (pH 7,4 при 4°С).