Свойства и механизмы регуляции НАД+киназы в онтогенезе Neurospora crassa

• Автор: Филиппович, Светлана Юрьевна
• Шифр специальности: 03.00.04
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 1985
• Место защиты: Москва
• Количество страниц: 171 c. : ил

ГЛАВА I. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ: ФЕРМЕНТАТИВНЫЙ СИНТЕЗ
НАДФ+ И ПРОЦЕССЫ ДИФФЕРЕНЦИРОВКИ
1.1. Роль никотинамидных коферментов в метаболизме
клетки и их участие в процессах дифференцировки
1.1.1. Функции НАД^ и НАДФ*
1.1.2. НАД*- и НАДФ+ как регуляторы активности ферментов
1.1.3. Соотношение НАД!- и НАДФ+ в клетках и его связь
с обменом веществ и дифференцировкой
1.2. НАД!"киназа и ее функции
1.2.1. НАД|киназа и превращения никотинамидных коферментов
1.2.2. Роль НАД4"киназы в дифференцировке и регуляции обмена веществ
1.2.2.1. Участие НАД^киназы в процессах дифференцировки 32
1.2.2.2. НАД^киназа и гормональный контроль
1.2.2.3. Роль НАД^киназы в адаптации
1.2.3. Возможные механизмы регуляции активности НЛДфкиназы
Глава II. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
2.1. Объект исследования
2.2. Условия культивирования
2.3. Получение бесклеточного экстракта
2.4. Обработка гомогенатов н.сгааэа при определении внутриклеточной локализации НАД^киназы
2.5. Определение активности НАД^киназы
2.6. Определение концентрации белка

2.7. Энзим-электрофорез
2.8. Определение молекулярной массы НАД^-киназы методом электрофореза в полиакриламидном геле
2.9. Определение молекулярной массы НАД^киназы методом гельфильтрации
2.10. Аналитическое изоэлектрическое фокусирование НАД|> киназы на пластинах полиакриламидного геля
2.11. Препаративное изоэлектрическое фокусирование НАД±-киназы в гранулированном геле - ультродексе
2.12. Реактивы
РЕЗУЛЬТАТ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ
Глава III. СВОЙСТВА НАД+КИНАЗЫ юзшюзрсжа СШ^БА
3.1. Внутриклеточная локализация НАД!"киназы ш.сгавза... 60
3.2. Оптимум pH И стабильность НАЛ!киназы и.сгавза при различных pH
3.3. Зависимость активности НАД^киназы к .сгазэа ОТ природы фосфорильного донора и присутствия ионов металлов ... 64
3.4. Влияние сульфгидрильных реагентов на активность
НАД^киназы И.сгазза
3.5. Влияние солей на НАД^"киназную активность ц.сгазБа.

3.6. Особенности поведения НАД^киназы при хроматографии на голубой сефарозе
Глава IV. ОЧИСТКА НАД^КИНАЗЫ ИЗ КЛЕТОК И.СНАЗЭА.
4.1. Разработка подходов к очистке НАД^киназы из N. сгазба 81
4.2. Получение очищенного препарата НАД^киназы из N.
сгаяза
4.3. Кинетические характеристики очищенного препарата
НАД^киназы Ц.сгазза
Глава V. НАД^КИНАЗА В РЕГУЛЯЦИИ МЕТАБОЛИЗМА И
ОНТОГЕНЕЗА и. crass А
5.1. Динамика удельной активности НАД^киназы в онтогенезе N.crassa
5.2. Регуляция активности НАС киназы N.crassa при фотостимуляции конидиогенеза и фотоиндукции каротиногенеза 100
5.3. Изменение удельной активности HAjfкиназы В клетках N.crassa , помещенных в стрессовые условия
5.4. К вопросу о кальмодулин-зависимой регуляции НАДІ"киназы N.crassa
Глава VІ. МНОЖЕСТВЕННЫЕ ФОРШ НАД^КИНАЗЫ n.crassa
6.1. Обнаружение множественных форм НАД^киназы у и.
crassa II3-II7
6.2. Множественные формы НАдфкиназы как маркеры дифференцировки У N.crassa . II7-I23
6.3. Изменение активности множественных форм НАД^киназы при фотостимуляции конидиогенеза N.crassa
ЗАКЛЮЧЕНИЕ
ВЫВОДЫ
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

териал сразу нее фиксировали жидким азотом.
2.3. Получение бесклеточного экстракта
В ряде предварительных опытов было проведено сравнительное изучение ВЛИЯНИЯ разных методов разрушения клеток N.crassa на активность НАД+киназы. Оказалось, что при применении ультразвука (22 кгц четырехкратно по I мин с минутными перерывами) с последующей гомогенизацией (30 сек; II00Q об/мин) выход по белку в полученном гомогенате сравним с таковым при разрушении клеток путем растирания в жидком азоте, однако активность фермента при этом не обнаруживается. Поэтому для разрушения клеток N.crassa была выбрана обработка их жидким азотом. Клетки разрушали растиранием в ступке с жидким азотом в течение 15 мин, экстрагировали белки при слабом перемешивании 0,05 М трис-HGl бу-фером pH 8,3 в течение 30 мин и центрифугировали при 20000g 30 мин. Надосадочную жидкость диализовали в течение ночи против того не буферного раствора. Все указанные операции проводили при 2-4°. В полученном материале определяли активность НАД+ки-назы.
2.4. Обработка гомогенатов N.crassa при определении внутриклеточной локализации НАД+киназы
Дифференциальное центрифугирование для определения внутриклеточного распределения фермента проводили по методу Брейна и др. (Brain et al. ,1977). После растирания клеток N.crassa в жидком азоте к ним добавляли 0,05 М фосфатный буфер, содержащий 250 мМ сахарозу и 10 мМ MgCig и полученный гомогенат последовательно центрифугировали при 2000, 9000, 20000, 50000 и I05000g в течение 10,15,30,75 и 120 мин соответственно. Аликвоты полученных осадков (кроме первого), ресуспендированных в свежей порции буфера, и супернатантов диализовали в течение ночи про-