Структурно-функциональные исследования белка рековерина

• Автор: Щульга-Морской, Сергей Владиславович
• Шифр специальности: 03.00.04
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 1998
• Место защиты: Пущино
• Количество страниц: 139 с. : ил.

1 СПИСОК ИСПОЛЬЗОВАННЫХ СОКРАЩЕНИЙ
2 ВВЕДЕНИЕ
3 ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ
3.1 Молекулярные механизмы передачи сигнала в
ФОТОРЕЦЕПТОРНОЙ КЛЕТКЕ
3.1.1 Родопсин
3.1.2 Трансдуцин
3.1.3 сОМР-фосфодиэстераза
3.1.4сЄМР-зависимьій катионный канал
3.2 Механизмы выключения сигнала в фоторецепторной клетке и восстановление темнового состояния
3.2.1 Выключение родопсина
3.2.2 Выключение трансдуцина и фосфодиэстеразы
3.2.3 Светозависимое изменение [Са2+]/в фоторецепторной клетке
3.2.4 Гу анилатциклаза
3.3 Са2+-связывающие белки НСП, принимающие участие в фототрансдукции
3.3.1 Общая характеристика Са2+-связывающих белков, содержащих структуру типа ''ЕР-ЪапР''
3.3.2 Общая характеристика кальмодулина
3.3.3 Активатор гуанилатциклазы
3.3.4 Активатор гуанилатциклазы
3.3.5 Рековерин
4 ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ
4.1 Материалы
4.2 Методы

4.2.1 Работа с ДНК и генноинженерные манипуляции
4.2.2 Выделение мутантных рекомбинантных рековеринов
4.2.3 Определение степени миристоилирования рекомбинантных рековеринов
4.2.4 Кальциевый блот
4.2.5 Изучение связывания кальция рековерином и его мутантами флуоресцентным методом
4.2.6 Определение протеолитической активности делеционных мутантов рековерина
4.2.7 Выделение наружных сегментов палочек сетчатки (НСП)
4.2.8Получение сетчаточного рековерина
4.2.9Получение родопсинкиназы и отмытых мочевиной мембран НСП68
4.2.10 Получение родопсинкиназы с использованием рековериновой колонки
4.2.11 Фосфорилирование родопсина в суспензии НСП
4.2.12 Определение активности родопсинкиназы в реконструированной системе, содержащей отмытые мочевиной мембраны НСП и очищенную родопсинкиназу
4.2.13 Аналитические процедуры
5 РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ
5.1 Получение миристоилиров анной и
НЕМИРИСТОИЛИРОВАННОЙ ФОРМ РЕКОМБИНАНТНОГО РЕКОВЕРИНА И СРАВНЕНИЕ ИХ ФУНКЦИОНАЛЬНОЙ АКТИВНОСТИ С СЕТЧАТОЧНЫМ РЕКОВЕРИНОМ
5.2 Получение, выделение и структурно-функциональные
СВОЙСТВА ДЕЛЕЦИОННЫХ МУТАНТОВ РЕКОВЕРИНА

5.2.1 Протеолитические свойства мутанта рековерина р2бА29
5.3 Получение, выделение и структурно-функщональные
СВОЙСТВА ТОЧЕЧНЫХ МУТАНТОВ РЕКОВЕРИНА
5.3.1 Выделение мутантных форм рековерина
5.3.2 Проверка способности мутантных форм рековерина

связывать Са
5.3.3 Исследования вторичной структуры точечных мутантов рековерина в зависимости от концентрации кальция
6 ВЫВОДЫ
7 СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

кальцийсвязывающих регуляторных белков будет уделено основное внимание в этой части работы. Также будут рассмотрены некоторые члены семейства рековериноподобных белков.
3.3.2 Общая характеристика калъмодулина
Кальмодулин - небольшой белок [118,119,120,121,122] с
1УЬ¥=Т7 кДа, содержит четыре ЕР-йапс! Са2+-связывающих участка и выступает в роли регулятора различных Са2+- зависимых процессов в эукариотических клетках. Связывание Са2+ кальмодулином (К = 10°-10"6М) приводит к конформационным изменениям, позволяющим кальмодулину распознавать и связывать белки -мишени с высокой афинностью (Ка = 10’7-10"пМ); среди последних -киназа легкой цепи миозина [120], многофункциональная кальмодулинзависимая киназа II [123], протеинфосфатаза 2В [124], фосфодиэстераза [125], аденилатциклаза [126], белки цитоскелета [127] и т.д.
3.3.2.1 Механизм регуляции активности ферментов кальмодулином
Механизм регуляции активности ферментов кальмодулином наиболее хорошо изучен на примере кальмодулинзависимых киназ и фосфатаз: киназы легкой цепи миозина, кальмодулинзависимой киназы II, киназы фосфорилазы, фосфатазы 2В и фосфатазы кальцийневрина. Перечисленные ферменты содержат в своем составе псевдосубстратную последовательность, способную взаимодействовать с каталитическим центром фермента. Последовательность ’’псевдосубстратного” фрагмента представляет собой аутоингибирующий домен, который конкурирует с