Сравнительное изучение Na+-транслоцирующих NADH:хинон оксидоредуктаз из Vibrio harveyi, Klebsiella pneumoniae и Azotobacter vinelandii

• Автор: Фадеева, Мария Сергеевна
• Шифр специальности: 03.00.04
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2008
• Место защиты: Москва
• Количество страниц: 90 с. : ил.

Список сокращений
Обзор литературы
1. История открытия и изучения натрий-транслоцирующей
КАИНхиноц-оксидоредуктазы
2. Субъединичный состав фермента, гомология субъединиц с другими белками
3. Кофакторы
4. Каталитические активности ИаМ^Я
5. Ингибиторы реакций, осуществляемых Иа+-Ы<ЗК
6. Роль кофакторов и возможные механизмы работы 1Ча+^С)11
7. Другие ^тАБН:хинон-оксидоредуктазы, присутствующие в
дыхательной цепи прокариот
Материалы и методы
1. Штаммы микроорганизмов, использованные в работе
2. Выращивание бактериальных штаммов
3. Получение клеточного лизата и суббактериальных частиц
4. Выделение рекомбинантного препарата №+-П(?К
5. Получение рекомбинантных фрагментов субъединиц ИцгВ и ЫцгС
6. ЭПР-спектроскопия
7. Измерение концентрации белка
8. Измерение концентрации натрия
9. Регистрация окисления ИАБН, ПАПРН и бПАЭИ
10. Генетические методы:
11 Измерение (1-галактозидазной активности
12 Определение различных металлов в препаратах N(311
13 Электрофоретическое разделение белков
14 Перенос белков методом Вестерн-блоттинга
15 Метод иммуноблотгинга
16 Экспериментальный протсолиз СБЧ

Результаты
1. Регуляция экспрессии оперонов, кодирующих Ыа+-транслоцирующую
ИАОНгхинон-оксидоредуктазу у V. harveyi и К. pneumoniae
2. Каталитические свойства натрий-транслоцирующей NADH:xhhoh
оксидоредуктазы из V harveyi, К. pneumoniae и A. vinelandii
3. Анализ мембранной топологии субъединицы NqrC
натрий-транслоцирующей ИАОНгхинон-оксидоредуктазы из V. harvey
4. Сайт-напрабленный мутагенез консервативных остатков
цистеина в субъединицах NqrD и NqrE
Обсуждение
Выводы
Список литературы
СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ
ДМСО - димстилсульфоксид ДТТ - 1,4-дитио-ВЬ-треитол Кз - менадион (витамин Кз)
Км - константа Михаэлиса
ОНФГ - о-нитрофенил-Р-Б-галактозид
СБЧ - суббакгериальные частицы
ТМАО — триметил И-оксид
ЭПР - электронный парамагнитный резонанс
СССР - .и-хлоркарбонилцианид фенилгидразон
ОМ - н-додецил мальтозид
сПЧАВН - восстановленный никотинамидгипоксантиндинуклеотид
ЕЫВСЖ - двойной электронно-ядерный магнитный резонанс
Б1 - окисленный флавин
ЕІНг - восстановленный флавин
Е1Н* - нейтральный флавосемихинон
И"--анионный флавосемихинон
НС^ЕТО - 2-//-гептил-4-гидроксихинолин Х-оксид
0 - убихинон QH2 - убихинол
01 - 2,3-диметокси-5-метил-6-изопренил-1,4-бензохинон ЬВАО — лаурилдиметиламин Ы-оксид
Ыа+/е‘ — нормированное на количество электронов количество ионов натрия, перенесенных через мембрану ферментом дыхательной цепи
N011-1 - бактериальная НҐ-траислоцирующая ЫАВН:хинон-оксидоредуктаза, аналог митохондриального Комплекса I
N011-2 - бактериальная несопряженная ЫАВН:хинон-оксидоредуктаза №+-ЫС)К - Ма+-транслоцирующая ХАВН:хинон-оксидоредуктаза ДрН - трансмембранная разность значений pH
А /2 н+ — трансмембранная разность электрохимических потенциалов ионов водорода; А/7ыа+ - трансмембранная разность электрохимических потенциалов ионов натрия;
Ду - трансмембранная разность значений электрических потенциалов.
анаэробных условиях, и специфические активности Ма+- N<311, измеренные на СБЧ, выделенных из этих клеток.
Таблица 8. Значения Р-галактозидазных активностей клеток V. Иатеуі КЗ/рМоЬгі, выращенных в аэробных и анаэробных условиях, и с1ЫАВН:К3-оксидоредуктазных активностей СБЧ, выделенных из этих клеток.
Условия роста ß-галактозидазная активность1 сМАПН:Кз-оксидорсдуктазная активность СБЧ2
+С>2 1,34 1,77
-02 0,007 0,0004
'р-галактозидазные активности приведены в мкмоль образованного о-нитрофенил-р-О-галактопиранозида в минуту на мг белка.
‘с1ЫАВН:К3 оксидоредуктазные активности приведены в мкмоль окисленного (с!)МАОН в минуту на мг белка.
1.1 Зависимость экспрессии nqr-oneponoe V harveyi и К. pneumoniae от фазы роста этих микроорганизмов.
Как видно на рис. 8А, экспрессия конструкции nqrAwlacZ. в клетках V. harveyi/pMobZl практически не меняется в ходе роста данной бактерии. Она максимальна в ранней логарифмической фазе роста и лишь незначительно понижается - в поздней логарифмической фазе и в раннем стационаре. В случае К. pneumoniae LZ102 экспрессия nqr.dacZ минимальна в ранней логарифмической фазе роста и значительно повышается в стационарной фазе (рис. 8Б). В дальнейшем для изучения влияния различных факторов на экспрессию nqr клетки V. harveyi и К. pneumoniae отбирались в середине логарифмической фазы роста.
4.0 s
3.5 §
3.0 I
2.5 S ,
з.» ! J
1.5 S :
1.0 | 1 п
0.5 g 0,0
3 4
Время, час
4 5 6
Время, час
0,6
0.5 £ я
04 5
0.3 S 'S
0.2 Є S 0.1 §
Рисунок 8. Зависимость [3-галактозидазной активности V. harveyi R3/pMobZl (А) и К.
pneumoniae LZ102 (Б) от фазы роста этих микроорганизмов. Сплошной линией показано увеличение во времени оптической плотности культуры при 600 нм, пунктирной линией — изменение р-галактозидазной активности во время роста культуры Здесь и далее 1 Е Р-галактозидазной активности соответствует 1 мкмоль расщепленного о-нитрофенил-р-О-галактопиранозида в минуту.